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사람 적혈구 막에서 노화와 손상에 의한 protein carboxyl methylation의 변화

사람 적혈구 막에서 노화와 손상에 의한 protein carboxyl methylation의 변화
Other Titles
changes of protein carboxyl methylation in human erythrocyte menbrance by ageing and damage
Issue Date
대학원 화학과
사람적혈구 막노화손상
이화여자대학교 대학원
Protein carboxyl methyltransferase(S-adenosyl methionine: protein carboxyl O-methyltransferase, EC catalyzed the methyl esterification of free α-carboxyl group in L-iso-aspartyl residue of its substrate protein using S-adenosyl-L-methionine as a methyl donor. For the purpose of showing physiological role of stoichiometric methyl esterification by protein carboxyl methyltransferase(PCM) as a post-translational modification, the intact human erythrocyte populations are separated by percoll/hypaque density gradient centrifugation according to ageing. PCM activity in cytosolic fraction and methylatability of erythrocyte membrane was measured at each cell layer. The level of cytosolic PCM activity of each cell layer has shown insignificant change according to ageing, but a two fold increase of membrane protein carboxyl methylation was observed in the oldest cells compared with the youngest ones. From this result, we can presumed that PCM activity does not increase according to ageing, but abnormal peptides as a substrate for the enzyme are formed during deamidation or oxidative damage events which accompony the ageing process of protein molecules in cell. We observed the level of methylatability of abnormal membrane protein by simple chemical treatment in vitro. After heat treatment(at 80℃), base treatment(incubation with 0.IN NH_(4)0H at 37℃) or UV light radiation(at 4℃), the extent of the methylation of the treated membrane also increased as a function of time. To compared with in vitro damage, we studied for diabetic blood as a example of in vivo damage. The more increased Hb A_(1c)/total blood(%), the more increased methylatability of diabetic erythrocyte membrane. From these results in vivo and in vitro, we showed that the ability of methyl esterification by PCM in vivo convert damaged protein into normal protein. It is consistent with the repair mechanism that physiological role of mammalian PCM convert abnormal L-iso-aspartyl residue into normal L-aspartyl residue via cyclic succinimide. Erythrocyte membrane protein was separated by CPC/PAGE in order to show protein participated in methylation. Band 3 and band 4.5 were good substrate for the PCM, methylatability of these protein increased according to ageing. From diabetic blood methylatability of erythrocyte membrane protein increased than normal one, in band 2.1, band 4.5 and band 3. Concerned with these protein physiological role, it presumed that methylation reaction affect membrane transport and erythrocyte shape.;Protein carboxyl methyltransferase(S-adenosylmethionine : protein carboxyl O-methyltransferase, EC는 S-adenosyl-L-metionine을 methyl donor로 사용하여 기질 단백질 중의 L-iso-aspartyl 잔기에 있는 free α-carboxyl을 group을 메칠화 하여 protein methyl ester 생성 반응을 촉매한다. 번역 후 변형(post-translational modification)의 한 예로, protein carboxyl methyltransferase(PCM)에 의한 메칠화 반응의 생리적 기능을 알아보기 위해 percoll/hypaque density gradient centrifugation 방법으로 사람 적혈구를 노화된 정도에 따라 분류하고, 각 층에서 세포질 내의 PCM 활성도와 적혈구 막의 methylatability 변화를 관찰하였다. 그 결과 노화된 정도에 따라서 적혈구 막의 methylatability는 증가하였고, 세포질 내의 PCM 활성도는 변화가 없었다. 이것은 적혈구가 노화되어감에 따라 세포질 내 효소 활성도가 증가하는 것이 아니라, 효소에 대한 기질인 비정상 단백질이 노화에 수반되는 탈 아미노 현상(deamidation)이나 산화적 손상 (oxidative damage)에 의해 증가함을 의미한다. 또한 적혈구 막을 염기(0.1N NH_(4)OH로 37℃ 항온 처리), 열(80℃ 에서 가열), 혹은 자외선(4℃ 에서 조사)으로 손상을 입힌 후 methylatability를 측정한 결과, 시간의 함수로써 증가 하였다. 이러한 생체 외적인 손상과 비교하기 위해, 생체 내적인 손상의 예로써, 당뇨병 환자 적혈구 막의 methylatability를 조사해 본 결과 Hb A_(1c)/total blood(%)가 커짐에 따라 methylatability가 증가하였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 생체의 노화에 따라 비정상 단백질이 증가하며, 생체내에서 PCM에 의한 메칠화 반응은 손상된 단백질을 정상의 단백질로 회복시키는 것임을 시사한다. 이것은 포유동물 PCM의 생리적 기능으로 가정되고 있는, 비정상의 L-iso-aspartyl 잔기가 cyclic succinimide를 거쳐 정상의 L-aspartyl 잔기로 바꿔주는 수복 기전을 뒷받침해 주고있다. 메칠화 반응에 관여하는 단백질의 종류를 알아보기 위해, 전기 영동 (cetylpyridinium chloride/acrylamide slab gel electrophoresis)에 의해 적혈구 막 단백질을 분리해 본 결과 band 3 와 band 4.5 이 PCM에 대한 좋은 기질임이 확인되었고, 이들 단백질의 methylatability가 노화되어지는 정도에 따라 증가하였다. 당뇨병 환자의 경우 band 2.1, band 4.5 그리고 band 3의 methylatability가 정상인에 비해 증가하였다. 이들 단백질의 기능과 연결시켜 볼 때 메칠화 반응은 막의 물질 이동이나 적혈구 모양에 관계됨을 암시한다.
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일반대학원 > 화학·나노과학과 > Theses_Master
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