알카리성 Bacillus sp. AL-8 알카리성 amylase 유전자의 E. coli와 B. subtilis로의 cloning과 발현된 amylase의 특성

Abstract

본 연구실에서 cloning 한바 있는 호알카리성 amylase 유전자를 포함한 재조합 플라스미드를 지니는 E. coli JW 균주의 효소적 성질을 조사한 결과 공여 균주인 Bacillus sp. AL-8과 동일한 성질을 나타내어 pH 10과 50℃에서 효소 활성이 최고로 높았으며 pH 8-10에서 안정하였고 50℃까지 매우 안정하였다. 5.7Kb의 EcoRI의 조각을 포함하는 형질전환 균주의 재조합 플라스미드는 E. Coli에서 효율적으로 발현되었다. PUB110에서 5.7Kb의 EcoRI 조각을 삽입하여 B. subtilis에 형질전환하여 공여 균주보다 동일한 효소 성질을 나타내면서 알카리성 amylase를 공여 균주보다 1.8배 더 생성하는 형질전환주를 얻었다. B. subtilis에서 알카리성 amylase 유전자를 포함한 재조합 플라스미드는 매우 안정하게 유지되었다. 5.7Kb의 DNA 조각내에서 알카리성 amylase 유전자의 위치를 밝히기 위해 pBR 325를 vector로 이용하여 E. coli에 subcloning한 결과 3.7kb의 EcoRI 조각안에 알카리성 amylase의 유전자가 존재함을 확인하였다.;Enzymatic properties of E. coli JW strains that were transformed with recombinant plasmids containing putative alkaline amylase gene were studied. For the construction o f the recombinant plasmid, the 5.7Kb EcoRI fragment was used. Alkaline amylase gene was efficiently expressed in E. coli and its enzymatic properties were indistinguishable from that of donor strain, Bacillus sp. AL-8. Thus, the alkaline amylase activity was maximum at pH10 and 50C. And that enzyme was very stable at pH 8-10 and up to 50C. When the EcoRI fragment was expressed in B. subtilis, the enzymatic properties were identical to that of donor strain. However, the activity was increased by 1.8 fold. And the recombinant plasmid containing the alkaline amylase gene was stably maintained in B. subtilis. In order to determine the location of the alkaline amylase gene wihtin the 5.7Kb DNA fragment, 5.7Kb DNA fragment was subcloned in E. coli. Based on the enzyme activity. of the subclones, it was found that the alkaline amylase gene located in EcoRI fragment of 3.7Kb.