Alantolactone과 Isoalantolactone의 Inducible Nitric Oxide Synthase(iNOS) 저해 및 암세포 성장 저해 작용 기전에 대한 연구

Abstract

Prostaglandins (PGs) and nitric oxide (NO), which are produced by cyclooxygenase (COX) and nitric oxide synthase (NOS), respectively, are essential to maintain homeostasis and host defense systems in human beings. However, overproduced PGs and NO by inducible cyclooxygenase (COX-2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS), respectively, can cause chronic inflammation, tissue damage, and carcinogenesis. In this view, the potential COX-2 or iNOS inhibitors have been considered as anti-inflammatory or cancer chemopreventive agents. To elucidate the active principles for iNOS inhibition from the n-hexane layer of Aristolochia debilis, bioassay-guided franctionations were performed, and two major active principles were isolated. The structures of these compounds were identified as alantolactone and isoalantolactone by several NMR experiments and instrumental analysis. Alantolactone and isoalantolactone showed potent inhibitory activity on LPS-induced nitrite accumulation in cultured RAW 264.7 cells (IC50= 0.34 and 0.6 mM, respectively). These effects were related to the suppression of iNOS protein and gene expression instead of the inhibition of enzyme activity or scavenging NO directly. Alantolactone and isoalantolactone also inhibited PGE2 production (IC50= 1.9 and 3.1 mM, respectively) in LPS-stimulated mouse macrophage cells via the suppression of COX-2 protein and gene expression. To further elucidate the molecular mechanisms by which allantolactone and isoalantolactone suppressed the COX-2 and iNOS expression, NF-kB and extracellular signal regulated kinase (ERK) were investigated in macrophage cells. Allantolactone and isoalanto-lactone moderately inhibited NF-kB binding activity, IkB-a degradation, and ERK activation, suggesting the possible involvement of NF-kB and ERK in the regulation of COX-2 and iNOS expression. In addition, the effects of alantolactone and isoalantolactone on the proliferation of human colon cancer cells were investigated. Alantolactone and isoalantolactone exhibited growth inhibitory activities on HCT-116 and HT-29 human colon cancer cells, and down-regulated endogenous COX-2 expression and serum-stimulated COX-2 expression in the COX-expressing HT-29 cells. Therefore, the anti-proliferating effects of alantolactone and isoalantolactone were somewhat related to down-regulation of COX-2 expression. These findings suggest that alantolactone and isoalantolactone might be potential lead candidates for anti-inflammatory or cancer chemopreventive agents. ; Nitric oxide synthase (NOS)와 cyclooxygenase (COX)는 체내 항상성 유지 및 염증 반응을 매개하는 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin (PG) 류를 생성하는 데에 필수적인 효소이다. NOS와 COX는 각각 3가지의 isoform으로 존재하는데, 이 중 growth factor나 각종 cytokine 류에 의해 발현되는 inducible nitric oxide synthase (iNOS) 및 cyclo-oxygenase-2 (COX-2)는 염증 반응을 통한 체내 방어 작용에 중요한 역할을 한다. 그러나 만성염증 질환에서와 같이 iNOS와 COX-2가 과발현되면 과잉 생산된 NO와 PG류에 의해 세포 및 조직 손상이 유발되어 결국에는 세포의 암화를 촉진하게 된다. 또한 암세포에는 COX-2 및 iNOS가 과발현 되어 있고, 이들은 암세포의 성장 및 전이를 촉진하고 apoptosis를 억제하는 작용이 있는 것으로 알려지고 있다. 따라서, 효과적인 COX-2 및 iNOS 저해제는 항염증제로서 뿐만 아니라 암의 진행 단계를 억제하여 암 발생률을 낮추는 암예방제로도 적용될 수 있다. 이러한 흐름에 맞추어, 본 연구에서는 청목향의 n-hexane 층에서 iNOS 저해 활성을 나타내는 유효 성분을 분리하고, 분리된 성분의 iNOS 저해 작용 기전을 알아보았다. 또한 이 물질이 암세포 성장에는 어떠한 영향을 미치는지를 평가하여 암예방제로적용될 수 있는지도 살펴보았다. iNOS 저해 활성 물질은 open column chromatography와 preparative HPLC를 이용하여 분리하였고, NMR을 이용한 구조 분석을 통하여, 활성 물질이 alantolactone 및 isoalantolactone임을 알 수 있었다. Alantolactone 및 isoalanto-lactone은 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 유도된 iNOS의 활성을 효과적으로 저해하였는데 이러한 작용은 iNOS 효소를 저해하거나 NO를 직접 소거하는 작용이 아니라 iNOS의 유도를 저해하는 작용을 통하여 이루어지는 것임을 확인할 수 있었다. 또한 이 두 물질은 COX-2에 의한 PGE₂ 형성도 저해하였으며, 이러한 작용도 마찬가지로 COX-2의 발현을 저해하는 기전을 통하여 이루어졌다. 그리고 alantolactone과 iso-alantolactone은 NF-kB 및 ERK의 활성화를 억제하는 기전을 통해 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 한편, alantolactone과 isoalantolactone은 사람 대장암 세포인 HCT-116 및 HT-29 세포의 성장을 농도 의존적으로 저해하는 활성을 나타내었다. 또한 세포 성장을 저해하는 농도를 처리하였을 때, 자체적으로 COX-2를 발현하는 HT-29 세포에 대하여 암세포 자체가 발현하거나 serum에 의해 유도된 COX-2의 발현을 억제하는 활성이 있는 것으로 나타나, COX-2 발현 저해 활성이 암세포 성장 저해 작용에 어느 정도는 연관이 있을 것으로 여겨진다. 결론적으로, alantolactone 및 isoalantolactone은 효과적인 항염증제로 적용될 수 있을 것으로 생각되며, 이러한 작용 및 암세포 성장 저해 작용을 통하여 alantolactone과 isoalantolactone은 암의 진행 단계를 지연시키는 암예방제 및 암세포를 사멸시키는 암치료제로도 적용될 수 있을 것으로 생각된다.