SK-N-BE(2)Human neuroblastoma 세포주의 growth factor와 ECM단백질의 신호전달 기작이상에 관한 연구

Abstract

In multicellular organisms, the behavior of individual cells such as their growth, differentiation, and migration is tightly controlled by their environment. Two major classes of controlling components are diffusible peptide growth factors and insoluble extracellular matrix (ECM) proteins. These molecules act independently and cooperatively on the cells. This study focused on the signal transduction pathway activated by peptide growth factors and ECM proteins in the human neuroblastoma cell line, SK-N-BE(2) [BE(2)]. A previous report in my laboratory demonstrated that BE(2) cells did not respond normally to the peptide growth factor such as insulin and NGF. To figure out why these cells did not respond to these growth factors, I examined insulin signaling in these cells. Tyrosine phosphorylation induced by insulin in BE(2) cells was much less than in PC12 cells although the tyrosine phosphorylation of insulin receptor was increased. The phosphorylation of IRS-1 in BE(2) cells was also increased less than in PC12 cells, and neither Grb2 nor GAP that regulates Ras activity interacted with the phosphorylated IRS-1. Moreover, MAP kinase, the downstream of Ras, was rarely activated by insulin in BE(2) cells. PI 3-kinase bound to IRS-1 and the activity of PI 3-kinase was increased by insulin in BE(2) cells. These results indicate that these cells may have some defects in the insulin-mediated Ras-MAP kinase activation. To find out whether Ras-MAP kinase pathway in BE(2) cells has defects, BE(2) cells were treated with pervanadate, a PTPase inhibitor. The tyrosine phosphorylation of many proteins, interaction of IRS-1 with Grb2, and MAP kinase activity were observed. These results suggest that BE(2) cells have defects not in Ras-MAP kinase cascade but in upstream of Ras-MAP kinase pathway activated by insulin. Recently it has been demonstrated that reactive oxygen species (ROS) including H2O2 and superoxide anion (O2-) is produced by cytokines and growth factors and may have a general role in mediating tyrosine phosphorylation through the inhibition of protein tyrosine phosphatases (PTPases). Insulin decreased ROS in BE(2) cells. To examine the possibility that the decrease of ROS by insulin could inactivate Ras-MAP kinase pathway, I applied H2O2 to BE(2) cells by adding glucose oxidase to the culeutr medium then treated the cells with insulin. Insulin enhanced the tyrosine phosphorylation of many proteins, interaction of IRS-1 with Grb2, and MAP kinase activity. To confirm the role of ROS in Ras-MAP kinase pathway, PC12 cells which respond normally to insulin were treated with N-acetylcysteine (NAC), a ROS scavenger, and the treatment of insulin was followed. Those results represented the opposite effects: NAC reduced the total tyrosine phosphorylation, interaction of IRS-1 with Grb2 and MAP kinase activity by insulin. These data represent that insulin-induced Ras-MAP kinase pathway requires an increase in intracellular H2O2. To identify a signaling molecule responsible for the defect of BE(2) cells in ROS generation, Rac1 gene from BE(2) cells was sequenced because Rac1 plays an important role in generating ROS in both phagocytic and nonphagocytic cells. The sequence of Rac1 in BE(2) cells has three substitutions in nucleic acids resulting amino acid changes. From these results, I concluded that the unresponsiveness of BE(2) cells to insulin is likely due to the abnormality of a ROS generation system that regulates Ras-MAP kinase pathway, and that abnormal Rac1 protein is the cause of this defect. I know that BE(2) cells have abnormal signaling pathway of insulin from the first part of this study therefore we examined the signaling activated by ECM proteins in BE(2) and Ras activity in the second part of this study. The ECM proteins, fibronectin or laminin, induced neurite extension in BE(2) cells. The vitamin A precursor, retinoic acid, produced a synergistic effect on neurite extension with ECM proteins. The expression of tyrosine hydroxylase, which is a marker of neuron, also increased when cells were treated with ECM proteins. These results indicate that ECM proteins induce the neuronal differentiation of BE(2) cells. To figure out which signaling pathways are responsible for the neuronal differentiation of BE(2) cells, we examined the tyrosine phosphorylation of proteins and focal adhesion kinase (FAK) activity. The treatment with either fibronectin or laminin increased tyrosine phosphorylation of several components and FAK. Though ECM proteins were able to activate FAK, they did not increased the association of FAK with Grb2. Moreover, the subsequent downstream events of Ras activation were not observed by ECM proteins. However, phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) was activated in response to both fibronectin and laminin. These results indicate that the ECM proteins, fibronectin and laminin, induce neuronal differentiation of BE(2) cell line and activate FAK and PI 3-kinase. But ECM proteins do not increase the interaction of Grb2 with FAK and do not activate Ras. From these results, we concluded that signaling generated by Ras activation is not necessary to extend neurites in this cell line.

Key words : signaling pathway, insulin, fibronectin, laminin, protein tyrosine phosphorylation, Ras-MAP kinase pathway, PI 3-kinase, ROS, Rac1, FAK ; 다세포 생물의 성장과 분화 및 이동 등의 모든 행동은 세포 밖의 환경에 의해 조절을 받는다. 대표적인 조절 요인은 growth factor와 extracellular matrix (ECM) 단백질로 이들은 서로 독립적으로 또는 공동으로 작용하여 세포에 영향을 준다. 본 논문은 growth factor에 대해서는 반응하지 않고 ECM에 의해서는 분화가 유도되는 SK-N-BE(2) [BE(2)] 세포에서 growth factor와 ECM 단백질의 신호 전달 기작에 대해 살펴보았다. BE(2) 세포는 인슐린을 처리하면 단백질의 타이로신 인산화가 인슐린에 대해 반응하는 PC12 세포보다 적게 일어난다. 이는 BE(2) 세포가 인슐린의 신호전달 체계에 결함을 갖고있음을 시사하므로 BE(2) 세포가 갖는 인슐린 신호 전달의 결함을 제 1장에서 분석하였다. BE(2) 세포에 인슐린을 처리하면 수용체가 활성화되지만 insulin receptor substrate-1 (IRS-1) 의 인산화가 PC12 세포보다 적게 일어났다. IRS-1은 Src homology 2 (SH2) domain을 갖는 downstream molecule중 growth factor receptor binding-protein 2 (Grb2) 나 GTPase activating protein (GAP) 과는 결합을 하지 못하였으며 Ras의 downstream에 있는 mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) 도 활성화되지 않았다. 그러나 IRS-1과 phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase) 의 결합이 인슐린에 의해 증가하며 PI 3-kinase의 활성도 증가하였다. PI 3-kinase는 활성화되고 Ras-MAP kinase pathway는 활성화되지 않는 이유는 Ras-MAP kinase cascade 자체가 비정상이기 때문일 수 있으므로 BE(2) 세포에 protein tyrosine phosphatase (PTPase) 억제제인 pervanadate를 처리하였을 때 신호 전달이 일어나는지를 조사하였다. BE(2) 세포에 pervanadate를 처리하면 단백질의 타이로신 인산화와 IRS-1의 인산화, IRS-1과 Grb2의 결합, MAP kinase의 활성이 증가하므로 BE(2) 세포의 Ras-MAP kinase pathway 자체에는 문제가 없음을 알았다. 최근 growth factor에 의해 세포 내 활성 산소종이 일시적으로 생성되고 이 활성 산소종이 PTPase를 억제하여 단백질의 타이로신 인산화가 증가될 것이라는 보고가 있으므로 (Finkel 1998) BE(2) 세포에 인슐린을 처리한 후 활성 산소종의 생성을 조사하였다. BE(2) 세포는 인슐린을 처리하면 오히려 활성 산소종이 감소하였다. 활성 산소종을 생성하지 못하는 것이 BE(2) 세포가 인슐린에 대해 반응하지 않는 이유인지 알아보기 위하여 BE(2) 세포에 glucose oxidase를 처리하여 미량의 H2O2를 생성하여 주고 인슐린을 처리하였다. 그 결과 인슐린에 의한 단백질의 타이로신 인산화가 증가하였으며 IRS-1의 타이로신 인산화와 IRS-1과 Grb2의 결합, MAP kinase의 활성이 증가하였다. 반대로 PC12 세포에 N-acetyl cysteine (NAC) 를 처리하여 활성 산소종을 없애주고 인슐린을 처리하면 인슐린에 의한 단백질의 타이로신 인산화가 감소하였으며 IRS-1의 타이로신 인산화와 IRS-1과 Grb2의 결합, MAP kinase의 활성이 억제 되었다. 이러한 사실로부터 활성 산소종의 생성이 인슐린에 의한 Ras-MAP kinase의 활성화에 필수적임을 알았다. 활성 산소종이 생성되지 않는 이유를 알아보기 위하여 활성 산소종의 생성에 필요하다고 알려진 Rac1의 핵산 서열을 조사한 결과 Rac1에 세 개의 돌연변이가 있음을 확인하였고 이러한 사실은 BE(2) 세포가 Rac1의 결함으로 활성 산소종이 생성되지 않을 가능성을 시사한다. 지금까지의 결과는 BE(2) 세포의 경우 Rac1의 결함으로 인슐린을 처리하여도 활성 산소종의 생성이 유도되지 않고 이로 인하여 Ras-MAP kinase pathway가 활성화되지 않으며 전체적인 타이로신의 인산화도 일어나지 않을 가능성을 말해주며 인슐린의 신호가 전달되기 위해서는 활성 산소종의 생성이 필수적임을 보여준다. 제 1장에서 BE(2) 세포의 Ras-MAP kinase 신호 전달에 결함이 있음을 알았으므로 제 2 장에서는 ECM 단백질에 의해 활성화되는 신호 전달이 정상인지를 확인하였다. BE(2) 세포에 fibronectin이나 laminin을 처리하면 신경 세포로 분화가 일어난다. 어떠한 신호 전달을 통해 분화가 유도되는지 알아보기 위하여 ECM단백질에 의해 타이로신 인산화가 증가하는지 알아본 결과 BE(2) 세포에 fibronectin이나 laminin을 처리하면 단백질의 타이로신 인산화가 증가하였다. ECM에 의한 단백질의 인산화에는 FAK이 관여하므로 FAK의 활성화를 조사한 결과 fibronectin과 laminin에 의해 FAK이 활성화되는 것을 알았다. Ras는 FAK의 downstream으로 BE(2) 세포에서는 growth factor에 의해 활성화되지 않았으므로 ECM을 처리하면 활성화되는지 알아 보았다. BE(2) 세포에 fibronectin이나 laminin을 처리하면 FAK과 Grb2와의 결합이 증가되지 않으며 Ras의 활성화도 유도되지 않았다. 반면 FAK의 downstream 중 하나인 PI 3-kinase는 fibronectin에 의해서도 laminin에 의해서도 활성화되었다. 이러한 결과는 BE(2) 세포는 ECM 단백질에 의한 분화가 일어날 때 FAK과 PI 3-kinase의 활성화는 일어나지만 Ras의 활성화는 유도되지 않으며 Ras의 활성화는 ECM에 의한 분화에 필요하지 않음을 말해준다. 1장과 2장의 결과를 종합해 보면 BE(2) 세포는 growth factor에 의해서도 ECM 단백질에 의해서도 Ras-MAP kinase의 활성화가 유도되지 않으며 Ras-MAP kinase의 조절 기작에 결함이 있는 세포임을 알았다. 이는 Rac1 단백질에 이상으로 활성 상소종이 생성되지 않기 때문이며 BE(2) 세포에서의 활성 산소종의 생성에 대한 연구는 아직 밝혀지지 않은 nonphagocytic 세포의 활성 산소종의 생성 체계를 밝히는데 도움을 줄 것이다.

핵심어 : 신호 전달 기작, 인슐린, fibronectin, laminin, 단백질 타이로신 인산화, Ras-MAP kinase pathway, PI 3-kinase, 활성 산소종, Rac1, FAK