안점의꽃갯지렁이(Pseudopotamilla occelata moore)의 난자형성 단계에 따른 난황립 전구체의 유입경로

Abstract

안점의 꽃 갯지렁이(Pseudopotamilla occelata Moore)에서 직경 5μm에서 180μm에 이르는 여러 크기의 난모세포들은 난자형성 전체 기간동안 체강액에서 부유하며 성장한다. 난모세포들이 동일한 체강에 노출되어 있으므로 체강액에 포함되어 있는 난황전구체 단백질이 난자형성의 특정단계에서 난모세포내로 투과될 것으로 생각되어 이 체강액 단백질(CFP)이 난자형성의 어느 단계에서 어떠한 경로를 통해 난모세포내로 유입되고 축적되는지 알아보기 위하여 금입자로 표지한 체강액 단백질(CFP-Au)에 난모세포들을 배양한 후 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 난모세포 표면층에서 CFP-Au가 미세융모의 끝부분 glycocalyx에 부착되어 있었고 미세융모 내부에도 위치하는 것으로 보아 체강액 단백질은 glycocalyx를 통해 미세융모로 유입된후 미세융모를 따라서 난모세포내로 유입되는 것으로 생각된다. 또한 난모세포의 세포질에서 CFP-Au가 표층세포질의 내포소낭과 세포질 전체에 분포하는 난황립의 전구체로 알려진 MVB 및 형성중인 난황립과 성숙한 난황립에서 관찰되는 것으로 보아서 체강액 단백질은 endocytosis과정에 의해 형성된 내포소낭에 의해서도 난모세포내로 유입되며, 난노세포내로 유입된 체강액 단백질은 난자형성 동안 MVB에서 응축되고 결정화 되는 과정을 거쳐 성숙한 난황립을 형성하는 것으로 생각된다. CFP-Au는 직경 70μm의 난모세포에서부터 발견되었으며 난자형성이 진행됨에 따라 난자 형성 중기의 난모세포에서 뿐 아니라 난자형성 중기와 말기의 난모세포에서 선택적으로 투과되는 것으로 나타났다. 난모세포 막의 단백질에 영향을 미칠 것으로 생각되는 Con A를 미리 처리한 후 CFP-Au에서 배양한 난자형성 중기의 난모세포들에서는 CFP-Au가 난모세포 표면층의 glycocalyx와 미세융모에서 그리고 세포질의 주로 형성중인 난황립에서 관찰되엇으며, 대조군과 비교하여 매우 드물게 나타난 것으로 보다 Con A에 의해 영향을 받는 난모세포막의 당단백질이 체강액 단백질을 난모세포내로 유입하는데 작용하는 수용분자와 관련이 있을 것으로 생각된다. 체강액 단백질이 난모세포내로 투과하는 과정에 G-protein이 관여 하는지 알아보기 위하여 난자형성 중기의 난모세포들에 GTP와 GTPγ S를 미리 처리하고 CFP-Au에 배양하였다. GTP를 처리한 경우 난모세포들에서 특히 glycoalyx 부위와 형성중인 난황립에서 대조군과 비교하여 많은 수의 CFP-Au가 관찰된 반면, GTPγ S를 처리하였을 때 CFP-Au는 주로 형성중인 난황립에서 대조군과 비교하여 비교적 적은 수로 관찰되므로 체강액 단백질의 유입과정에 G-protein이 관여하고 있다고 생각된다. 비특이적 단백질이 난모세포로 유입되는 양상을 알아보기 위하여 금입자로 표지된 Horseradish peroxidase(HRP-Au)에 난자형성 중기의 난모세포들을 배양하였을 때, HRP-Au 는 표면층의 glycocalyx와 미세융모내부에서 관찰되었고 세포질에서는 막구조물로 한정되지 않고 세포질에 노출된 채로 혹은 내포소낭과 MVB에 위치하였으며 이들 중 MVB는 난황립형성에 관여하는 형태의 MVB와 다르게 lysosome의 형태를 나타내는 것으로 보아 HRP는 난모세포로 유입된 후 체강액 단백질과는 다른 경로를 거치는 것으로 보인다. 이와같은 사실로 Pseudopotamilla occelata 난자형성 과정에서 난황전구물질인 체강액 단백질은 미세융모라는 통로를 통하여 그리고 endocytosis방식에의하여 선택적으로 난자형성 중기 및 말기의 난모세포내로 유입되어 난황립을 형성하는 것으로 보이며, 이 난황전구물질의 유입은 난모세포막의 당단백질 및 G-protein과 관련되어 있다고 생각된다. ; Yolk precursor protein in coelomic fluid is transported into the oocytes of specific stages although oocytes of all stages of Pseudopotamilla occelata Moore grow floating in the coelomic fluid throughout oogenesis. Internalization and accumulation of coelomic fluid proteins in oocytes were investigated by tracing the pathway of coelomic fluid proteins labelled with colloidal gold(CFP-Au) through transmission electron-microscopy. Coelomic fluid protein is internalized into the oocyte cytoplasm through the canals of microvilli. CFP-Au was observed in the endocytic vesicles, multivesicular bodies (MVBs), forming yolk granules and mature yolk granules. Coelomic fluid proteins in MVB are processed into yolk granules by the condensation and crystallization. CFP-Au were observed only in the oocytes of vitellogenic and postvitellogenic stages later than 70 μm in diameter, indicating coelomic fluid proteins are stage-specifically transported. Alteration of membrane proteins by saturating the carbohydrate residues of the proteins with concanavalin A(Con A) inhibited the transport of CFP-Au, implying that these altered glycoproteins of membrane of ppcutes may be related to receptors function in the internalization of coelomic fluid proteins. CFP-Au transport appears to be controlled by CTP-proteins, since the transport is enhanced by GTP but slowed down by CTPγ S. Horseradish peroxidase, a non-specific protein, is also internalized as CFP, but MVB containing the proteins showed lysosomal structures different from the one of yolk granule formation, suggesting that non-specific proteins may be degraded rather than processed into yolk granules.