분화유도체에 따른 HL-60 세포의 표현형및 기능변화

Abstract

본 연구에서는 HL-60 세포를 과립구로 분화시키는 N-N- dimethylformamide (DMF) 및 all-trans retinoic acid (ATRA)와 주로 단구로 분화시키는 1α-25-dihydroxycholecalciferol (vitamin D3)을 HL-60 세포에 첨가하여 배양하면서 분화단계에 따라 면역글로불린 수용체인 FcγI (CD64), FcγII (CD32)와 lipopolysaccaride (LPS) 수용체인 CD14 및 유착분자인 CD11c/CD18의 발현 정도를 조사하고, 아울러 이러한 분화과정 동안에 세포의 opsonophagocytic activity, respiratory burst의 기능적 변화와 apoptosis를 측정하였다. 연구방법은 HL-60 세포를 10% 우태아혈청이 함유된 RPMI 1640 배지에 5×105 cells/mL의 농도로 맞추어 각각 0.8% DMF, 1 μM ATRA 및 20 μg/mL vitamin D3를 첨가하여 배양하면서 분화유도 전과 분화유도 1, 2, 3, 4 및 5일째에 세포의 표현형 분석 및 기능 시험을 시행하였다. 연구 결과는 다음과 같았다. DMF, ATRA 및 vitamin D3에 의한 HL-60 세포의 분화 유도 시 CD64 발현은 자극 전에 비해 자극 후에 의미있는 변화를 나타내지 않았으며, 각 분화 유도제에 따른 CD64 발현의 차이도 보이지 않았다. CD32는 분화 유도 전에 비해 세 가지 분화 유도제에 의해 1일째부터 의미있는 증가 소견을 보여 FcγII 가 성숙한 중성구의 주된 수용체임과 부합하는 소견을 나타내었다. CD14는 분화 유도 전에는 발현되지 않다가 HL-60 세포를 주로 과립구로 분화시키는 DMF와 ATRA에 의해서는 3, 4일째에 의미있는 증가를 보인 반면, 단구로 분화시키는 vitamin D3에 의해서는 1일째부터 급격한 발현 증가를 보여 vitamin D3가 HL-60 세포를 단구로 초기부터 분화시킴을 알 수 있었다. 분화 유도 전에는 거의 발현되지 않던 CD11c는 세 가지 자극제에 의해 자극 후 1일째에 세 군 모두에서 의미있는 발현 증가를 나타내어 5일째까지 계속 증가하는 소견을 나타내었고, 세 가지 자극제에 의한 날짜별 CD11c의 발현의 의미있는 차이를 보이지 않았다. CD18은 분화 유도 전 76.5%의 높은 발현 정도를 보였고 DMF, ATRA 및 vitamin D3에 의해서 표현이 증가하였으며 각 자극제에 따라 표현의 증가에 차이는 있었다. DMF, ATRA 및 vitamin D3 자극에 의한 HL-60 세포의 기능 변화 중 respiratory burst의 측정 결과, 자극 전에 비해 DMF에 의해서는 자극 3일째에 의미있는 증가를 보였고 계속 증가하였다. ATRA에 의해서는 4일째에 급격한 증가를 보였으며, vitamin D3에 의해서는 이보다는 낮으나 역시 4일째에 의미있는 증가 소견을 나타내었다. Respiratory burst의 정도는 ATRA와 vitamin D3로 자극했을 때 DMF에 의한 자극 시 보다 훨씬 더 증가하는 소견을 나타내었다. 19F S. pneumoniae에 대한 opsonophagocytic activity를 HL-60 세포의 분화 정도에 따라 측정한 결과, 분화 유도전에는 opsonophagocytic titer가 49.7%로 나타났고 자극 1, 2일째에는 DMF로 분화시킬 때가 ATRA나 vitamin D3에 비해 의미있게 높은 소견을 보였으나, 5일째에는 모두 90% 이상의 opsonophagocytic titer를 나타내어 별 차이를 보이지 않았다. Apoptotic fraction은 HL-60 세포를 분화시키기 전에 1.8%였고, DMF와 ATRA에 의해서는 5일째에 20%까지 증가한 반면, vitamin D3에 의해서는 4일째까지 apoptotic cell의 증가를 보이지 않다가 5일째에 약간 증가하는 소견을 보여 apoptosis는 DMF나 ATRA로 자극했을 때보다 vitamin D3로 자극 시 월등히 낮음을 관찰할 수 있었다. CD32, CD14, CD11c, CD18의 발현정도와 opsonophagocytic activity와의 상관관계는 DMF로 자극했을 때 가장 좋은 것으로 나타났으며, 또한 CD11c가 opsonophagocytic activity와 상관관계가 높은 소견을 보였다. HL-60 세포를 DMF, ATRA 및 vitamin D3로 자극했을 때 각 분화 유도제에 따라 HL-60 세포의 분화 정도에 차이가 있음을 다양한 세포막 수용체와 유착분자들의 발현 정도의 차이를 보아 알 수 있었으며, 또한 자극제에 의한 분화유도 과정이 정상 백혈구 분화과정과 항상 일치하는 것은 아니라는 사실을 알 수 있었다. 특히 DMF에 의해 분화 유도시키는 경우 2일 간의 짧은 기간 동안에 HL-60 세포가 충분히 분화되는 사실을 확인할 수 있었고, vitamin D3의 경우 세포의 apoptosis 정도가 현저히 낮으므로 세포의 질은 가장 좋을 것으로 생각된다. 향후 항 폐구균 항체의 기능 시험에 사용되는 opsonophagocytic assay를 비롯한 HL-60 세포를 재료로 하는 여러 가지 실험에 본 연구의 결과가 적용될 수 있으리라 생각된다. ; In this study N-N dimethylformamide (DMF) or all-trans retinoic acid (ATRA) is used to differentiate promyelocytic cell line HL-60 into granulocytes and 1α-25-dihydroxycholecalciferol (vitamin D3) into monocytes, respectively. And the expressions of immunoglobulin receptors FcγRI (CD64) and FcγRII (CD32), LPS receptor CD14, and adhesion molecules CD11c/CD18 on HL-60 cells were quantified and also the functional studies including respiratory burst, opsonophagocytic assay and apoptosis were performed. HL-60 cells (5×105 cells/mL) were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and induced to differentiate by adding 0.8% DMF, 1 μM ATRA or 20 μg/mL vitamin D3. HL-60 cells were analyzed for phenotypic and functional differntiation before and 1, 2, 3, 4 and 5 days after the stimulation with each inducers. The results of phenotypic analysis showed that there were no significant differences in the expression of CD64 on HL-60 cells before and after the stimulation by DMF, ATRA or vitamin D3. The expression of CD32 on HL-60 cells increased significantly on the first day of stimulation by all three inducers, which shows that the FcγRII is the main receptor of immunoglobulins in mature granulocytes. There was no expression of CD14 before the induction of differentiation and it increased significantly on the day 3 by DMF and on the day 4 by ATRA induction. On the other hand, when induced by vitamin D3 the expression of CD14 increased significantly on the first day which shows that vitamin D3 differentiates HL-60 cells into monocytes in the earlier stages of differentiation. CD11c was not expressed on HL-60 cells before the induction of differentiation and the expression increased significantly on the first day of differentiation by all three inducers and increased continuously until the day 5. There were no significant differences in expression of CD11c by the three inducers. Seventy six percent of HL-60 cells already expressed CD18 before the induction of differentiation and the expression increased significantly by all three inducers. The results of respiratory burst showed significant increase in chemiluminescence on the day 3 and continuation of increase until the day 5 after indution of differentiation by DMF. Induction of differentiation by ATRA or vitamin D3 showed singnificant increase of chemiluminescence on the day 4. Differentiation by ATRA or vitamin D3 showed significantly higher level of respiratory burst than DMF. Opsonophagocytic assay using 19F S. pneumoniae killing assay showed 49.7% of opsonophagocytic titer before the differentiation induction of HL-60 cells. On the days 1 and 2 HL-60 cells stimulated by DMF showed significantly higher opsonophagocytic titer than by the other two inducers. However, by the day 5 the titer increased to over 90% by all three inducers and there were no significant differences in opsonophagocytic titer among the inducers. Apoptotic cell fraction of HL-60 cells before the differentiation was 1.8% and it increased to 20% on the day 5 by DMF or ATRA stimulations. On the other hand, induction by vitamin D3 showed no increase of apoptotic cell fraction until the day 4 and slightly increased to 3.6% on the day 5 which is still much lower than the fractions by DMF or ATRA stimulations. The correlation coefficiency between CD32, CD14, CD11c and CD18 and opsonophagocytic assay showed the high correlation between DMF induced phenotypes and opsonophagocytic titer and particularly CD11c showed high correlation with opsonophagocytotic activity. In summary, the study of phenotypic and functional assays and apoptosis by inducing differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cell line using various chemical and physiological mediators such as DMF, ATRA or vitamin D3 facilitates an understanding of myeloid cell differentiation as well as the variable expression of surface markers on myeloid leukemia cells. The level of differentiation of HL-60 cells varied depending on the inducer used. Especially induction by DMF showed early differentiation of HL-60 cells to more mature cells in just two days. And during vitamin D3 stimulation the apoptotic cell fraction was significantly lower than the other inducers, therefore it may be presumed that the quality of the differentiated cells would be much better than when induced by the other two inducers. The results of this study could be used as bases for the further studies using HL-60 cell line.