백굴채와 인삼의 항암 면역 증강 작용에 관한 연구

Abstract

면역계를 활성화하여 암 세포의 성장을 억제하고 암세포를 제거하는 물질로는 암에 대한 vaccine, 암의 표면 항원에 대한 항체, 유전자 재조합 cytokine, 미생물, 식물로부터 분리하거나 유기적 합성에 의한 cytokine 생성 유도 물질이 있다. 본 실험에서는, 민간의 한방에서 항암 및 조혈작용이 있다고 알려진 68종의 생약으로부터 항암 면역 증강 조절제를 탐색하고자 activated killer 세포(AK cell)의 생성능, 임파구 증식능, macrophage의 활성화 작용을 측정하여 백굴채와 인삼으로부터 활성물질을 분획하고 성분 분석 및 기전 연구를 수행하였다. 백굴채(白屈菜, Chelidonium majus의 전초)의 물 추출물로부터 분자량 17,000전후의 물질을 포함하는 단백다당체를 활성 물질로 분획하여, CM-AIa라고 명명하였다. CM-AIa는 단백질 15.8%, hexose 23.4%, uronic acid 13.2%로 구성되었고, hexose중에는 mannose, galactose, glucose를 구성 당으로 하고 있으며, CM-AIa에 함유된 단백질을 구성하는 아미노산으로는 glycine, glutamine 혹은 glutamic acid, asparagine 혹은 aspartic acid, alanine이 전체 함량의 48.04%를 차지하였다. CM-AIa를 열 처리하여 단백질을 불활성화 시켰을 때는 AK 세포의 생성능이 저하되었으나, 비장 세포의 증식은 영향을 받지 않았다. 인삼(人參, Panax ginseng)의 물 추출물로부터 PG-AIa(분자량 670,000), PG-AId(분자량 14,000~17,000)와 PG-AIIa(분자량 3,000~10,000), PG-AIIb(분자량 1,000~3,000), PG-AIIc(분자량 500~1,000), PG-AIId(분자량 500이하)를 분획하였다. 각각의 AK 세포 생성에 의한 암세포 독성을 측정한 결과, PG-AIa, PG-AIb, PG-AIId가 2mg/ml에서 다른 분획에 비하여 상대적으로 높은 활성을 나타내었다. 인삼으로부터 산성 다당체를 분리하기 위하여 인삼의 물 추출물에 80% ethanol을 처리하여 ginsan을 분리하였으며, PG-AIId로부터 저분자 물질로서 항암 면역 증강 작용이 있는 물질을 찾는 방법으로 분확한 결과, AK 세포 생성능이 상대적으로 높은 PG-AIId-Bl을 분리하였고, 대략적인 분자량은 370이었다. 증식능 실험과 유세포 분석에 의하면, CM-AIa와 ginsan은 IgM+ 세포에 대한 직접적인 분열 초ㅈ진제(mitogen)로 작용하였다. Thy1.2+ 세포에는 직접적인 분열 촉진제로 작용하지 않았으나, 살아있는 adherent cell(CD11b+ 10~15%, IgM+ 40~50%)과 함께 배양하면, Thy1.2+ 세포 증식을 유도하였다. CM-AIa는 peritoneal macrophage를 자극하여 nitric oxide의 생성을 유도하였으며, Yac-1에 대한 암세포 독성을 나타내었다. CM-AIa를 비장 세포와 함께 배양시에 macrophage에서 분비하는 IL-1b, GM-CSF, TNFa mRNA의 발현을 유도하였으며, Th 1 세포에서 분비하는 cytokine인 IL-4, IL-5의 발현을 유도하였다. Macrophage를 활성화하고 B 세포에 대한 분열 촉진제로 알려진 LPS는 adherent cell의 존재하에서도 CM-AIa와 ginsan과는 달리 Thy1.2+ 세포의 증식을 유도하지 않았으며 비장 세포로부터 AK를 생성하지 못하였으므로, CM-AIa와 ginsan은 LPS의 작용과는 차이가 있었다. 생체내 항암 효과를 알아보기 위하여 CM-AIa에 의한 B16-F10 흑색종의 폐로의 전이를 관찰한 결과 대조군에서 230개의 colony 생성을 확인하였고, CM-AIa를 0.5 mg/kg씩 격일로 3주간 복강 투여시 68개의 colony가 생성되어 B16-F10 melanoma의 폐로의 전이를 70.4% 억제하였다. 따라서,CM-AIa와 ginsan은 항암 면역 증강제로서 활용될 가능성이 있으며 특히 CM-AIa는 암의 전이에 대한 강력한 억제제로서 활용될 가능성이 있다. ; To develop the new biological response modifiers(BRM) from natural sources, the water extracts from 68 kinds of medicinal plants were investigated for activities to generate ax cells, proliferate splenocytes and stimulate macrophages. In this point of view, Chelidonium majus and Panax ginseng were selected to study about their chemical contents and biological activities. The CM-AIa(M.W. about 17,000)was fractionated from water extract of Chelidonium majus and composed of 15.8% of protein, 23.4% of hexose, and 13.2% of uronic acid. The sugar part of CM-AIa was composed of mannose, galactose and glucose and the major amino acids were glycine, glutamine or glutamic acid, asparagine or aspartic acid and alanine. The cytotoxicity of CM-AIa against Yac-1 by generation of activated killer cells (AK cells) and the proliferation of splenocytes were much higher than other fractions of Chelidonium majus. The generation of AK cells was inhibited by incubation with heat-inactivated CM-AIa but proliferation of splenocytes was not affected. The water extract(PG-A) from Panax ginseng was fractionated into PG-AIa(M.W. 670,000), PG-AIb(M.W. 158,000), PG-AIc(M.W. 17,000~40,000), PG-AId(M.W. 14,000~17,000) and PG-AIIa(M.W. 3,000~10,000), PG-AIIb(M.W. 1,000~3,000), PG-AIIc(M.W. 500~1,000), PG-AIId(M.W. below 500). The cytotoxicity of PG-Aia, PG-AIb and PG-AIId(M.W. below 500). The cytotoxicity of PG-AIa, PG-Aib and PG- AIId against Yac-1 by generation of AK cells was much higher than other fractions of Panax ginseng. The acidic polysaccharide, ginsan, was isolated by addition of 80% ethanol into water extract of Panax ginseng(PG-A) and PG-AIId-B1(M.W. about 370) was fractionated from PG-AIId with the activity of specific generation of AK cells. To study the target cells stimulated by CM-AIa and ginsan, Thy1.2+ cells and IgM+ cells and adherent cells from splenocytes were isolated by positive selection. By the results of proliferation test and flow cytometry analysis, CM-AIa and ginsan directly affected on IgM+ ells as strong B cell mitogens. But CM-AIa and ginsan did not directly affect on Thy1.2+ cells to proliferate but stimulated the live adherent cells followed to proliferate Thy1.2+ cells. Also, CM-AIa included the production of nitric oxide from peritoneal macrophages and showed the antitumor activity against the Yac-1. The CM-AIa induced the expression of macro[hage type cytokine mRNAs such as IL-1b, GM-CSSF, TNFa from splenocyts as well as Th 1 type cytokines such as IL-2 and IFNg and Th 2 type cytokines such as IL-4 and IL-5 mRNA. The activities of CM-AIa and ginsan were contrasted with lipopolysaccharide(LPS) in the point that Thy1.2+ cells did not proliferate in the presence of live adherent cells by LPS and LPS did not generate AK cells from splenocytes. Also, the CM-AIa inhibited the pulmonary metastasis of B16-F10 melanoma by 70.4% at 0.5 mg/kg of CM-Aia. This result showed the strong antitumor activity of CM-AIa against the metastatic tumor cells and suggested the possible role as an anti-metastastic agent. As a result, CM-AIa and ginsan could be used for antineoplastic immunostimulator and applied to cancer patients to prevent metastasis after surgery with other therapeutic methods.