Methicillin resistant staphylococcus aureus에 대한 chitosan의 항균성과 항균시험방법에 관한 연구

Abstract

The purpose of this study was to develop an antibacterial fiber against Methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA), one of the world s most harmful pathogenic bacteria by applying chitosan to the raw meterial. To achieve this purpose effectively, it was necessary to optimalize the processing to improve the antibacterial activity and cleaning-resistances of the existing fibers in common use such as cotton and polyester and to develop objective and trustworthy antibacterial test methods that could precisely evaluate and measure the antibacterial efficiency of the new fiber finished with chitosan/acetic acid solution. The possibility of using chitosan antibacterial finishing varies broadly by the molecular weights of it and so does the finishing itself that it is important to specificate chitosan in the aspect of molecular weight during the finishing. For this study, chitosan with different molecular weights were primarily sampled to measure the exact weight of each chitosan through Gel permeation Chromatography. And secondarily a precision technology was applied not only to the specification of chitosan in the aspect of molecular weight but also to the control of molecular weight dispersion below 2.0 degree to minimize the impact of molecular weight dispersion upon the antibacterial activity. Therefore water insoluble chitosan of which molecular weights came under 2,000,000, 500,000, 80,000 and 40,000 while maintaining over 90% of deacetylation were made and put to various antibacterial tests. The moleculur weight of chitosan didn t exert significant influences on its antibacterial activity against MRSA but antibacterial activity was a little strong when the molecular weight was 40,000, 80,000 and 150,000. As for the antibacterial action against aerms, water-soluble chitosan barely showed an action, while active actions were shown when chitosan was mixed with acetic acid solution. This means that when chitosan is dissolved in an acetic acid solution, its-NH₂ radical changes into the positive -NH₃+ ion, which acts upon the surface of the cell wall of bacterium obstructing its metabolism, destroying its cell wall and finally eliminating it. Consequently speaking, the absolute content of -NH₂ radical inherent in chitosan seems to determine the overall functions of it. Meanwhile, the test fabrics were treated with a chitosan/acetic acid solution and put in a NaOH solution to make the -NH₃+ ion change into -NH₂radical and then put to an antibacterial test. But no sign of its antibacterial activity. And as a result of testing repeatedly, there revealed the possibility of chitosan to become a nutrient for bacteria when it exists in the state of -NH₂radical rather than -NH₃+ion. Considering the antibacterial activity of chitosan against MRSA is determined by the degree of deacetylation, a chitin and a low molecular chitosan with 82.4% of deacetylation were produced through acetylification of a water insoluble chitosan with over 90% of deacetylification. And then they were applied to MRSA, and as a result water soluble chitins with more or less 50% of deacetylation showed low degrees of antibacterial activity than the chitosan with over 90% of deacetylation. The chitosan/acetic acid solution showed higher degrees of antibacterial activity when it had been kept at a low temperature for 7 days than when it was immediately used, and this was the same with low molecular water soluble chitosan in spite of having no antibacterial activity. This means that chitosan dissolved in acetic acid solution causes another new changes in the molecular structure as time goes on. As a result of testing the antibacterial activity of chitosan itself and the test fabrics with six methods being most commonly used around the world such as Shake Flask Method, Modified Shake Flask Method, AATCC Test Method 100, Modified AATCC Test Method 100, Bacteria Number Measurement Method and OD Method, MIC values to MRSA were different by each method and the degrees of the test fabric s antibacterial activity were inconsistent, so these results were not trustworthy. Therefore in this study, two antibacterial test methodes developed through improving and supplementing the existing methods are presented as recommendable; one is Agar Plate Smear Method, and easy and objective testing method on the antibacterial activity of antibacterial agent itself and the other is Agar Plate Contact Method, and effective one on the antibacterial activity of chitosan finished fabrics against MRSA. ; 본 연구는 키토산(chitosan)을 원료로 하여 세계적으로 문제가 되고 있는 병원성 균 Methicillin Resistant Staphylococcus aureus(MRSA)에 대응하는 항균섬유를 개발하는데 있다. 개발목적을 효율적으로 달성하기 위하여 기존에 상용되고 있는 섬유인 면, 폴리에스테르에 후 가공방법을 통한 항균성과 내세탁성을 향상시키기 위하여 가공공정을 최적화시키고, 키토산으로 가공 처리된 섬유제품의 항균성능을 정확하게 평가할 수 있는 객관적이고 신뢰성 있는 새로운 항균가공섬유의 항균성능 측정방법을 개발하는 것이다. 항균가공에 사용한 키토산은 분자량의 크기에 따라 키토산 자체의 기능성이 광범위하게 변화될 뿐만 아니라 항균가공 공정도 변화하게 되므로 분자량 측면에서 키토산의 특성화가 키토산에 의한 항균가공시 중요하다. 본 연구에서는 분자량이 상이한 키토산을 1차적으로 취득한 다음 Gel Permeation Chromatography(GPC)를 이용하여 분자량의 크기를 정확하게 측정함으로써 우선 분자량 측면에서 키토산을 특성화시킴과 동시에 분자량 분산도도 2.0 이하로 조절할 수 있는 정밀기술을 적용시킴으로써 분자량의 분산이 항균성에 미칠 수 잇는 가능성을 최소화 시켰다. 따라서 탈 아세틸화도가 90% 이상 유지되면서 분자량의 크기가 200만·50만·8만·4만에 해당되는 수 불용성 키토산을 제조하여 다양한 항균성시험을 하였다. 키토산의 분자량은 MRSA의 항균성에 큰 영향을 미치지 않았지만 분자량 4만·8만·15만 일 때 항균성이 약간 더 우수하게 나타났다. 키토산의 미생물에 대한 항균기작은 수용성 키토산일 경우 거의 발현되지 않았고 키토산/아세트산 수용액 상태일 때 항균성이 우수하게 나타났다. 이것으로 미루어 보아 키토산을 산성용액에 용해시키면 -NH₂기가 -NH₃+ 형태의 양이온으로 변화될 뿐만 아니라 세균의 세포막 표면이 음하전을 띄고 있기 때문에 세포막의 표면에 -NH₃+ 양이온이 작용하여 세균의 물질대사를 방해하고 아울러 세포막을 파괴시킴으로써 세균을 사멸시킨다고 판단된다. 결과적으로 키토산 내부에 존재하는 -NH₂기의 절대함량이 키토산의 제반기능성을 절대적으로 지배한다고 판단했다. 한편, 키토산/아세트산 수용액을 시험포에 도포시키고 NaOH 수용액 속에 침지하여 -NH₃+상태를 -NH₂기로 변화시킨 다음 항균테스트를 실행했던 바 항균력이 발현되지 않았다. 반복시험결과 -NH₃+상태가 아닌 -NH₂기 상태로 존재할 경우에 키토산이 세균의 영양원으로 될 가능성이 있다고 판단했다. MRSA에 대한 키토산의 항균성은 탈아세틸화도에 의해 좌우된다는 점을 감안하여 탈아세틸화도 90%이상인 수불용성 키토산을 아세틸화시켜 만든 키틴과 탈아세틸화도 82.4%인 저분자 키토산을 MRSA에 적용시켰을 때 탈아세틸화도 50% 안팎의 수용성 키틴들은 탈아세틸화도 90% 이상인 키토산보다 항균력이 낮았다. 키토산/아세트산 수용액을 용해시킨 후 즉시 사용할 때 보다 저온에 7일간 방치한 다음 사용하면 항균력이 월등하게 높아졌다. 뿐만 아니라 저분자 수용성 키토산일 경우엔 항균성이 없었는데도 불구하고 높은 항균성을 나타냈다. 즉 산 수용액에 용해시킨 상태에서는 시간 경과와 더불어 제 3의 분자 구조상의 변화를 수반한다고 생각했다. 더 정확하고 신뢰성 있는 키토산 자체의 항균력과 키토산 처리 포의 항균성을 검토하기 위해서 세계적으로 가장 많이 이용하는 Shake Flask Method, 개량 Shake Flask Method, AATCC Test Method 100, 개량 AATCC Test Method 100, 균수측정법 그리고 OD Method 등 6가지 방법으로 시험한 결과 MRSA에 대한 Minimum Inhibition Concentration(MIC) 값이 각각 달랐을 뿐만 아니라 키토산 자체의 항균력과 키토산처리포의 항균력 간에도 일관성이 없었기 때문에 신뢰성을 부여할 수 없었다. 따라서 본 연구에서는 기존 항균시험방법의 문제점들을 보완·개선하여 다음 2가지 항균시험방법을 제시했다. 첫째로 섬유의 항균가공에 이용되는 항균제 자체의 항균력을 간편하고 객관적인 평가방법으로 Agar Plate Smear Method를 둘째로 키토산 가공섬유의 MRSA항균성 평가에 대해서는 Agar Plate Contact Method를 각각 도출했다.