Enzymatic evidence for a mitochondrial inhibitor of guanine aminohydrolase in rat liver

Abstract

Guanine aminohydrolase（EC 3.5.4.3; GAH）exerts an important role in purine metabolism catalyzing transformation of free guanine to xanthine and ammonia; and its natural inhibitor of intrinsic origin, as a regulatory ligand, has been a problem of interest. The author presented enzymatic evidences in the present paper for its existence in the mitochondrial fraction of rat liver. For this purpose, rat liver GAH was purified 51.2 fold, recovering 63% of its activity from the 100,000g supernatant precipitated with ammonium sulfate-saturated fraction, followed by Sephadex G-200 column chromatography. Natural inhibitor of GAH was, on the other hand, purified 50.0 fold with a 20% recovery of activity from 700g through 5,000g pellet of the rat liver homogenate. Treatment with triton X-100, precipitation with ammonium sulfate, extraction with NaCl solution, and DEAE-cellulose column chromatography were adopted in the purification procedure of the inhibitor. GAH activity was observed to have ubiquitous distribution among tissues studied showing high activity in lung and liver while low activity in brain and kidney. It was shown that GAH has a broad optimum pH near 7.5, is stable to heat, and inhibited by Li+, Ag+, Pb++, Hg++, Zn++, and Fe+++, but not by Ca++, Cu++, and Mg++. The natural inhibitor of GAH was proved in the present study to be associated with the heavy mitochondrial fraction of the rat liver, proteineous in nature, and heat-labile. Its activity was completely lost when incubated at 50 ℃ for 5 min. the isolated inhibitor needed, for its activity, PC in addition, which protected the inhibitor, and was precipitated with TCA, which strongly suggest the inhibitor to be membrane-bound protein. The presence of “natural inhibitor protein” in the mitochondrial fraction of rat liver for GAH would provide means of physiological regulation of purine catabolism. ; Guanine aminohydrolase（EC 3.5.4.3; GAH）는 guanine이 xanthine과 ammonia로 전환되는 과정을 촉매하는 효소로, purine대사에 중요한 역할을 하고 있기 때문에, 이 효소의 활성을 조절하는 ligand로서 이 효소와 함께 존재하는 natural inhibitor가 연구의 대상이 되고 있다. 본 연구는 흰쥐 간 조직의 mitochondria분획에 GAH의 natural inhibitor가 존재하고 있음을 효소학적으로 확인하기 위해 시행하였다. 흰쥐 간 조직의 파쇄액을 100,000g로 원심분리하여 상청액을 황산암모늄으로 염석시킨 후, Sephadex G-200크로마로그라피를 이용하여 GAH를 회수율 63%로 51.2배 정제하였고, GAH의 natural inhibitor는 같은 조직의 파쇄액을 700g 상청액을 5,000g 로 원심 침전시킨 분획을 Triton X?100으로 처리하여 황산암모늄으로 염석시킨 후, NaCl용액으로 추출한 액을 DEAE?cellulose크로마로그라피로 정제하여 20%의 활성이 회수되었고 그 정제율은 50배였다. GAH의 활성은 모든 조직에서 검출되었는데, 폐장과 간장에서 높은 활성을 , 뇌와 신장에서 낮은 활성을 보였다. 또한 GAH는 pH 7.5 근처에서 완만한 최적 pH을 나타내었고, 열에 안정하며, Li+, Ag+, Pb++, Hg++, Zn++ 및 Fe+++ 등의 금속이온에 의해 그 활성이 저해되는 반면, Ca++, Cu++ 및 Mg++는 아무런 영향도 미치지 않았다. GAH의 natural inhibitor는 흰쥐간 mitochondria분획에 결합되어 있는 단백질이며 열에 불안정함을 보였다. 분리정제된 GA의 natural inhibitor는 그 활성의 발현과 열에 대한 안정성을 위해 phosphatidyl choline을 필요로 하였고, TCA에 의해 침전되었다. 이러한 일련의 특성들은 GAH의 natural inhibitor가 생체막에 결합된 단백질임을 강력히 시사해주고 있다. 흰쥐간 mitochondria분획에 “natural inhibitor protein（NIP）”이 존재한다는 사실은 purine이화대사를 조절하는 기전의 하나로 생각되어진다.