인간의 배양임파구에서 Benzo[a]pyrene에 의해 유도된 유전독성검사지표에 대한 GSTM1, GSTT1과 CYP1A1의 역할

Abstract

다환방향족탄화수소는 흡연, 산업, 대기오염, 음식섭취, 의약품 등에 의해 일반대중이 쉽게 노출된다. 이 다환방향족탄화수소는 CYP1A1에 의해 대사 활성화를 거쳐 DNA에 독성이 있는 중간대사물질을 생성하고 GSTM1과 GSTT1에 의해 해독화과정을 거치는 것으로 알려져 있다. 다환방향족탄화수소에 관여하는 이들 효소의 대사 활성도, 또는 DNA에 독성이 있는 중간대사물질의 정화를 조절하는데 있어 개인간 변이가 가능하다고 본다. 따라서 본 연구에서는 환경 중 가장 널리 분포하고 있는 다환방향족탄화수소의 대표적인 노출지표인 유전독성물질인 Benzo[a]pyrene을 인간의 배양임파구에 투여하여 발암물질과 관련된 유전독성을 GSTM1, GSTT1과 CYP1A1 측면에서 살펴보고 이들 유전자형의 역할에 대해 규명해 보고자 하였다. 1998년 3월 건강진단을 시행받기 위해 산업의학과에 내원한 인하대학교 병원 근로자 중 건강한 비흡연 남자 근로자 30명을 연구 대상으로 하였다. 연구 대상자들로부터 정맥혈 5 ㎖를 채취하여 임파구를 분리하여 배양하였다. DMSO에 Benzo[a]pyrene 5 ㎍/㎖와 10 ㎍/㎖를 녹여 임파구에 각각 투여한 후 24시간 동안 배양하여 세포증식억제로 세포독성을 평가하였고 DNA fluorometer로 형광을 측정함으로써 DNA-protein crosslinks (DPCs) 양을 정량하여 유전독성을 평가하였다. GSTM1, GSTT1, CYP1A1(MspI)과 CYP1A1(Ile-Val)의 유전자형은 polymerase chain reaction(PCR)을 이용하여 결정하였다. 본 실험결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. Benzo[a]pyrene을 주었을 때 세포수의 감소가 양-반응관계를 보이며 DNA 손상에 미치는 DPCs 형성정도도 양-반응관계를 보이며 증가하여 세포독성 및 유전독성이 있음을 보았다. 2. 유전자형에 따른 세포독성 효과의 차이를 살펴보면 GSTM1 결손형이 그렇지 않은 군보다 세포수의 감소가 나타났고 이러한 현상은 Benzo[a]pyrene 10 ㎍/㎖ 처리군에서 더욱 뚜렷하였다. 그러나 GSTT1 유전자형에서는 이러한 효과가 분명치 않았다. CYP1A1(MspI)과 CYP1A1(Ile-Val) 유전자형에서는 m1/m1, Ile/Ile형에서 세포수가 감소하였으며 특히 Benzo[a]pyrene 5 ㎍/㎖ 처리군에서 뚜렷하였다. 3. 유전자형에 따른 DPCs의 형성정도도 GSTM1 유전자가 결손될 때 GSTM1 유전자를 가지고 있는 군에서보다 증가를 보였으며 CYP1A1(MspI)과 CYP1A1(Ile-Val)의 경우에는 m1/m2 또는 m2/m2, Ile/Val 또는 Val/Val형에서 m1/m1, Ile/Ile형보다 DPCs 형성이 약간 증가하였다. 그러나 GSTT1 유전자형에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다. 4. GSTM1과 GSTT1의 조합에서는 Benzo[a]pyrene 10 ㎍/㎖ 처리군에서 GSTM1과 GSTT1 유전자 모두가 결손된 군에서 가장 높은 수준의 DPCs 형성을 보여주었고, GSTM1과 CYP1A1(MspI) 유전자형과의 조합에서는 GSTM1 결손에 CYP1A1(MspI)의 m1/m2 또는 m2/m2의 mutant allele형이 동반된 경우에 가장 높은 수준의 DPCs가 형성됨을 보았다. 그러나 CYP1A1(Ile-Val) 유전자형과의 조합에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다. 본 연구의 결과 Benzo[a]pyrene의 유전독성효과에 대한 인간의 배양 임파구의 감수성에 GSTM1이 중요한 역할을 하며 GSTM1이 결손된 경우 유전독성의 위험이 증가하는 경향을 보여주었다. 또한 GSTM1 결손에 CYP1A1(MspI)의 mutant allele형이 결합되었을 경우에 그 위험은 더욱 증가하는 경향을 보여주었다. ; Polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) are widely distributed in the environment. Epidemiological studies have shown an increase in cancer incidence among workers exposed to PAHs. Benzo[a]pyrene is one of a large number of PAHs and is frequently used as a representative indicator of total PAH levels. Benzo[a]pyrene is then metabolically activated by the cytochrome P450 to an highly reactive electrophilic form including phenol, trans-dihydrodiols(diols), and chemically reactive arene oxides and diol-epoxides which can bind covalently to DNA. This covalent binding is thought to be responsible for many of the observed cytotoxic, mutagenic, and carcinogenic effects. Metabolically detoxication is induced by the Glutathione S-transferase (GSTs) enzyme which are multifunctional proteins. GSTM1, GSTT1 and both of these polymorphisms have been shown to include a homozygous null genotype characterized by the lack of a detectable GSTs gene and deficiency of the respective GSTs enzyme. Several studies have shown a bimodal distribution among blood donors in the sensitivity of their cultured lymphocytes to the induction of genotoxicity by the PAHs. We investigated the influence of the GSTM1, GSTT1, and and CYP1A1 genes on DNA-protein crosslinks (DPCs) induction by B[a]P in cultured human lymphocytes. Samples of lymphocyte were collected from 30 healthy and nonsmoking hospital workers. DPCs were detected with K-SDS assay and the distribution of GSTM1, GSTT1, and CYP1A1 was determined by polymerase chain reaction. The results were as follows: A highly significant increase in DPCs was obtained by 10 ㎍/㎖ of Benzo[a]pyrene in cultures of all donors, but individual DPCs responses were higher among the GSTM1 null than GSTM1 positive donors. However, there was no differences in DPCs formation according to GSTT1 gene. In CYP1A1 gene at 10 ㎍/㎖ Benzo[a]pyrene, individual DPCs responses were slightly higher among the mutant allele of both of MspI and Ile-Val genotype of donor. In the combination of genes, the DPCs responses were higher among GSTM1 null genotype combined with GSTT1 null genotype, and GSTM1 null genotype combined with mutant allele type of CYP1A1(MspI). The findings indicate that the sensitivity of human lymphocytes to the genotoxic effects of Benzo[a]pyrene depends on the interaction of GSTM1 null and GSTT1 null genotype, and GSTM1 null and CYP1A1(MspI) mutant allele genotype of the donor.