Preparation and characterization of calcium phosphate cements incorporated with platelet rich plasma

Abstract

골 시멘트란 생체재료의 일종으로 손상된 골 결손 부위를 채워주거나 뼈와 임플란트 사이의 빈 공간을 메워주는 역할을 한다. 골 시멘트의 일종인 인산칼슘계 시멘트는 α- 및 β-TCP가 가장 많이 사용되고 있으며, 보다 합성이 용이한 β-TCP가 주로 쓰이고 있다. β-TCP를 기반으로 한 인산칼슘 시멘트는 우수한 생분해성을 가지는데 비해 기계적 강도가 낮은 단점을 가지고 있다. 반면 α-TCP는 인산칼슘 시멘트 제조 시 골 성분인 하이드록시아파타이트 (HAp)를 생성하고, 우수한 기계적 강도를 나타내지만 TCP 합성 시 α-상의 수율이 낮은 단점이 있다. 이러한 인산칼슘 시멘트의 단점을 보완하기 위하여 α-TCP의 효율적 합성법을 연구하고, 골 전도성 및 유도성 증가를 통해 골 형성 능력을 향상 시키고자 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 도입하여 인산칼슘 시멘트 (CPC)를 제조하였다. α-TCP 합성 시 출발물질로 DCPA와 DCPD를 각각 사용하였으며, TCP내 α-상의 함유율을 결정짓는데 중요한 요인인 급랭 방법을 보완하고자 냉매로 드라이아이스를 이용하여 합성하였다. 기존의 합성 방법인 DCPA를 출발물질로 한 상온냉각법 (DCPA-r.t.)으로 합성한 α-TCP는 66 %의 수율을 가지는 반면에 DCPD를 출발물질로 한 드라이아이스 냉각법 (DCPD-dry ice) 으로 합성한 경우에는 TCP 내 α-상의 비율이99% 이상으로 높은 α-상의 수율을 나타내었다. 각기 다른 방법으로 합성된 α-TCP를 사용하여 제조한 CPC의 특성을 비교 분석한 결과, DCPD-dry ice 방법으로 합성한 α-TCP를 사용한 경우가 α-TCP 함량이 높아 8분 정도의 초기 경화시간을 가지며, 간접인장강도 2.5 MPa, 압축강도 13 Mpa로 가장 높은 기계적 강도를 나타내었다. 또한 SEM 및 XRD 분석을 통하여 다른 조건의 α-TCP를 사용한 시멘트에 비해 더 많은 양의 HAp 생성량을 나타내는 것을 확인하였다. 가장 우수한 특성을 나타낸 DCPD-dry ice방법으로 합성한 α-TCP를 사용하여 CPC를 제조하고, CPC의 골 형성 능력향상 시키고자 제조 시 PRP를 첨가하였다. PRP의 도입으로 인해 인산칼슘 시멘트의 반죽이 묽어져 기계적 물성이 낮아졌으나 HAp 생성에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 혈소판 유래 성장인자 (PDGF-bb, bFGF)의 방출은 시간에 따라 직선적으로 증가하였고, 시멘트 제조 후 10일이 경과하면 성장인자의 방출은 거의 종결되었다. PRP 첨가량에 따라 방출된 성장인자의 농도는 PDGF-bb 120 ~ 540 pg/ml, bFGF 70 ~ 310 pg/ml정도로 차등하게 나타났다. 또한 인산칼슘 시멘트에서 48시간 동안 조골세포 (Saos-2 cell)를 배양한 결과, 혈소판 풍부 혈장을 첨가하지 않은 시멘트는 6x104 cells/cement, 첨가한 시멘트에서는 약 3배 정도 많은 17x104 cells/cement 가 증식되었다. 또한 PRP첨가량이 증가할수록 시멘트 표면에 배양된 세포는 보다 넓은 면에 안정적으로 부착되어 있는 것을 관찰하였다. 이러한 결과를 통하여 CPC 제조 시 적당량의 PRP 첨가는 CPC의 생체 활성에 영향을 미치는 것을 확인하였다.;α- and β-tricalcium phosphate (TCP) are the most frequently used materials for preparing calcium phosphate cement (CPC). While β-TCP can be easily synthesized, it has low mechanical properties. On the other hand, α-TCP forms HAp when preparing calcium phosphate cement and it has better mechanical properties than the cement prepared by β-TCP. However it is difficult to synthesize α-TCP, and besides, it yields a small amount of α-phase. The purposes of this study are 1) the improvement of the synthetic method of α-TCP to enhance its yield, 2) the preparation and characterization of platelet rich plasma (PRP)-incorporating calcium phosphate cement using α-TCP for improving biocompatibility such as cell activity and osteogenesis. Calcium phosphate anhydrate (DCPA) and calcium phosphate dihydrate (DCPD) were used as starting materials for preparing α-TCP. Dry ice was also used as a refrigerant for the quenching process in preparing α-TCP. α-TCP in this study, wherein, DCPD was used as a starting material and the quenching process was carried out with dry ice(DCPD-dry ice) had the α-phase yield of 99% and over, while α-TCP synthesized by the existing synthetic method wherein DCPA was used as a starting material and the quenching process was carried out at room temperature(DCPA-r.t.) had the α-phase yield of 66%. The comparison between CPCs synthesized by the different methods showed that CPC prepared with α-TCP of DCPD-dry ice had a high α-TCP content and the initial setting time of approximately 8 min and the highest mechanical properties with the indirect tensile strength of 2.5 Mpa, the compressive strength of 13 Mpa. The SEM and XRD analyses showed that CPC prepared with α-TCP of DCPD-dry ice had the higher HAp yield than the other CPCs. CPC was prepared with α-TCP of DCPD-dry ice which had the excellent properties, and PRP was added in the preparing in order to enhance osteogenesis, Due to the addition of PRP, CPC became watery thereby reducing the mechanical properties, but it did not affect the HAp yield. The releases of platelet-derived growth factors (PDGF-bb, bFGF) straightforwardly increased as time passed, and the releases were almost terminated after 10 days from the preparation of CPC. The concentrations of the released growth factors varied in the amounts of the added PRP, i.e., PDGF-bb - 120 ~ 540 pg/ml, bFGF - 70 ~ 310 pg/ml. In addition, as a result of culturing osteoblasts(Saos-2 cell), CPC incorporated with platelet rich plasma had the osteoblasts of 17x104 cells/cement, nearly three times those of CPC without platelet rich plasma, i.e., 6x104 cells/cement. It was observed that the cells cultured on the surface of CPC were adhered to the wider surface as the amount of the added PRP increased. Thus, it was confirmed that the suitable addition of PRP in preparing CPC affects the biocompatibility of CPC.