Identification of CHIP-Hsp70 as the E3 ligase complex for Ino80 chromatin remodeling enzyme

Abstract

Recent studies show that INO80 complex, belonging to the family of ATP-dependent chromatin remodeling complexes, functions in a wide range of biological processes, including transcription, DNA repair and replication. However, the mechanisms that regulate the cellular levels and functions of the INO80 complex have remained largely unexplored. Our laboratory has recently observed that the cellular levels of Ino80, the catalytic ATPase of the INO80 complex, are controlled by the ubiquitin-proteasome degradation pathway. Although we have identified BRCA1-associatied protein 1 as the ubiquitin C-terminal hydrolase that deubiquitinates and stabilizes Ino80, the E3 ligase that ubiquitinates Ino80 has remained to be discovered. In this thesis, I showed that Ino80 is polyubiquitinated via both K48 and K63 linkages, suggesting that Ino80 ubiquitination can serve as a protein degradation marker as well as a marker for signals. I identified Hsp70 as a protein that binds to Ino80 in the manner that is dependent on Ino80 ubiquitination. Since Hsp70 was known to form a complex with CHIP E3 ubiquitin ligase, I investigated whether CHIP functions as the E3 ligase for Ino80. I observed that CHIP binds to Ino80 in the similar way as Hsp70. An overexpression of CHIP increases Ino80 ubiquitination and decreases the cellular levels of Ino80 whereas CHIP mutant lacking the catalytic U box domain does not show such activities. Hsp70 is necessary for the activities of CHIP to bind and ubiquitinate Ino80. Finally, mass spectrometry analysis identified a number of ubiquitination sites downstream of the Hsp70-CHIP binding region of Ino80. My work therefore demonstrates that the CHIP-Hsp70 complex functions as the E3 ligase for Ino80. In addition, my work suggests that Ino80 ubiquitination not only plays role in regulating the cellular levels of Ino80 but also possibly serve as signals for the diverse cellular functions of Ino80.;크로마틴 리모델링 복합체의 한 종류로 잘 알려진 INO80은 DNA의 전사, 복제, 손상복구 등 cell 안에서 필수적인 사건에 있어 중요 역할을 한다고 알려져 있다. 최근 우리 실험실에서는 INO80이, 탈유비퀴틴 효소인 Bap1에 의해 복제 fork의 안정성 유지에 밀접한 관련이 있다는 연구결과를 보았다. 이에 따라 본 연구에서는 Ino80의 유비퀴틴화가 그 기능과 안정성 유지에 밀접한 관련이 있다고 생각, 탈유비퀴틴 효소인 Bap1에 상호반대 작용을 하는, Ino80의 유비퀴틴화를 담당하는 유비퀴틴 효소(E3 ligase)로써 CHIP-Hsp70 복합체를 찾았고 그 역할을 밝혔다. 프로테오좀 저해제로 잘 알려진 MG132를 이용한 실험에서 Ino80이 유비퀴틴화-프로테오좀 기작에 의해 조절 받는다는 가장 기본적인 가설을 증명 할 수 있었고, 또한 Ino80의 단편을 이용한 실험에서 Ino80의 C-말단부분, 1120번째 아미노산 이후가 Ino80의 유비퀴틴에 중요한 역할을 하는 지역이라고 밝혀내었다. 이 곳에 선택적으로 붙는 단백질을 탐색한 결과, 흥미롭게도 질량분석법 (mass spectrometry) 결과에서 샤페론 단백질로 알려진 Hsp70, Hsp7C 등이 나왔고. 면역침강(immunoprecipitation) 실험을 통해 Ino80와 Hsp70간의 결합을 증명해 낼 수 있었다. 샤페론단백질의 결합은 이들을 소단위체로 이용하는 CHIP복합체가 Ino80의 유비퀴틴 효소일 수 있다는 것을 시사하는 결과였다. Myc-CHIP 과 발현 실험에서 예상한 바와 같이 Ino80의 유비퀴틴화는 증가하였고, 안정성은 감소하였다. 이러한 실험결과는 CHIP에 의한 Ino80의 유비퀴틴화 뿐만 아니라 Ino80의 안정성에 중요한 유비퀴틴화 자리로 거론할 수 있는 위치를 제시함으로써 Ino80의 유비퀴틴화에 대한 기작을 규명한 데 의의를 둘 수 있다. 또한 Ino80의 유비퀴틴화가 Lys48 유비퀴틴화로써 프로테오좀으로 가 분해되는 신호로 작용할 뿐만 아니라, Lys63 유비퀴틴화로써 Ino80의 세포 내 역할에 있어 활성화 신호로 작용할 수 있음을 시사한다.