Novel ALK5 inhibitor에 의한 유방암 세포의 폐암 전이 억제 작용에서 MMP-9/2 활성에 대한 연구

Abstract

Extracellular matrix는 소극적인 형태의 생물학적 장벽으로 인식되어 왔다. 그러나 Steven Paget의 “seed and soil” 이론이 대두되면서, 암세포의 고착이 일어나는 장소인 tumor microenvironment에 주목하게 되었다. ALK5 억제제인 EW-7197과 EW-7273은 TGF-βR1에 선택적으로 작용하는 항암제로 개발되었다. 종양은 끊임없이 생체 내의 다른 세포, 다른 조직들과 상호작용하고 있기 때문에 ALK5 억제제인 EW-7197, EW-7273이 tumor microenvironment를 이루는 개별 요소들에 어떤 영향을 주는지 연구하였다. MMPs는 ECM의 분해에 있어서 필수적인 단백분해효소인데, 이 중에서도 gelatinases는 collagenases에 의해 분해된 fibral collagen을 최종적으로 분해하는 역할을 함으로써 전이에서 중요한 역할을 하고 있다. EW-7273은 MDA-MB-231, 4T1 세포에서 TGF-β에 의해 유도되는 MMP-2, MMP-9의 mRNA의 생성을 억제하며, MDA-MB-231, 4T1, MCF-10A에서는 MMPs 효소 활성 또한 기저 수준으로 저하시키는데, 이로써 EW-7273은 유전자 발현 및 효소로서의 활성 발현을 억제하여 암세포의 침투, 전이, 혈관신생에 필요한 과정인 ECM 분해 및 tissue remodelling을 억제한다. 또한, EW-7197은 MCF-10A에서 TGF-β에 의해 유도되는 효소 활성 및 단백량을 조절하며, MMP-2/MMP-9 mRNA 역시 감소시키는 것으로 확인되었다. 이러한 gelatinases의 생체 내 활성을 확인하기 위해서 in vivo gelatin zymography를 실시하였다. 그 결과, 1차 고형암에서의 MMP-2 및 MMP-9의 활성은 농도 의존적으로 높아지는 경향을 나타내었으나, 폐에서는 투여 농도 의존적으로 활성이 낮게 나타나 유방암이 1차적으로 전이되는 폐에서의 gelatinase의 활성이 낮았다. 이것은 EW-7197이 유방암의 대표적 전이 장소인 폐의 ECM의 분해를 억제하여, 전이성 암세포가 정착하기 어렵게 함으로써 암의 전이를 억제하는 것으로 생각된다. 또한, 폐에서의 MMP-9/MMP-2 효소활성비는 암의 전이정도와 상관관계를 보인다는 것을 확인하였다. 그리고 in vitro에서는 확인되지 않았던 MMP-2의 존재가 in vivo에서 확인됨으로써, MMP-2의 활성에 영향을 미치는 면역세포의 역할을 주목하게 되었다. Tumor-associated macrophages는 암조직에서 가장 많이 존재하고 있는 면역세포의 형태이다. 암의 전이에서 TAMs이 암세포와 맺고 있는 상호관계는 매우 중요하다. 따라서 면역세포와 암세포간의 상호작용을 살펴보기 위해 RAW264.7 및 4T1 세포를 이용하여 in vitro co-cultivation을 실시한 결과, MMP-2의 발현은 살펴볼 수 없었으나 MMP-9 외에 55 kDa에서 또 다른 gelatinolytic band가 관찰됨으로써, 그들 간의 상호작용이 다른 종류의 MMPs를 발현시키는데 관여한다는 사실을 확인하였다. 전이성 암의 치료에 있어서 세포 외 기질 분해 억제 효과 이외에 혈관신생억제 효과도 중요한 기전이다. 혈관신생에 미치는 ALK5 억제제의 효능을 알아보기 위해 in vitro HUVECs tube formation assay를 실시하였다. 그 결과, VEGF의 존재 하에서 ALK5 inhibitor인 EW-7197이 혈관 신생을 억제한다는 것을 확인하였다. 따라서, EW-7197은 TGF-β에 의한 MMPs 효소 활성의 억제에 기인한 ECM 분해 억제 효과를 가짐과 동시에 VEGF에 의한 혈관신생도 함께 억제함으로써, EW-7197이 효과적인 항암작용을 가진다는 것도 확인할 수 있었다. 이번 연구를 통해, EW-7273과 EW-7197의 ECM에 대한 in vitro, in vivo에서의 작용, 혈관신생에 대한 작용, 암세포 주변 세포들과의 상호작용에 대해서 개괄적으로 살펴보았다. 따라서, EW-7197 및 EW-7273은 암의 전이 및 혈관 신생을 모두 억제할 수 있는 효과적인 항암제로서의 귀추가 주목된다.;Extracellular matrix has been recognized as a biological barrier of the passive form. However, emerged Steven Paget’s "seed and soil" theory, the importance of tumor microenvironment where cancer cell adhesion may occur was emphasized. EW-7197 and EW-7273, ALK5 inhibitors, had been developed as anti-cancer agents that act selectively on TGF-βR1. Because the tumor cells always interact with other cells and tissues, this study was dealt with how ALK5 inhibitors work on these different elements of the tumor microenvironment. MMPs are proteolytic enzymes that are necessary for degradation of ECM. Above all, gelatinases play an important role in metastasis by finally degrading fibral collagen primarily degraded by collagenases. EW-7273 reduces TGF-induced MMP2/9 mRNAs and MMP2/9 enzyme activities in MDA-MB-231 and 4T1, and EW-7197 reduces MMP2/9 mRNA and enzyme activities in MCF-10A. Therefore, this study confirmed that EW-7197 and EW-7273 suppressed ECM degradation and tissue remodelling. To determine the in vivo activity as a gelatinases, in vivo gelatin zymography was performed in tissues of 4T1 xenograft BALB/c mice. As a result, in the lung where primarily metastatic sites of breast cancer, MMP-2 and MMP-9 activities were inversely proportional to EW-7197 dose. Tumor-associated macrophages are most abundant immune cells in the tumors. Therefore, it is important how TAMs interact with cancer cells. Under the cultivation of combination with RAW264.7 and 4T1, gelatinolytic band by MMP-2 was not identified, but at 55 kDa, other gelatinolytic band was observed, which would be identified whether other types of MMPs was expressed or not. In the treatment of metastatic cancer, inhibition of angiogenesis is as important as inhibitory effect for the degradation of the extracellular matrix. In vitro HUVECs tube formation assay was performed for ALK5 inhibitors’ effect on angiogenesis. As a result, in the presence of VEGF, EW-7197 was found to inhibit angiogenesis. Thus, EW-7197 has a suppressive effect on ECM degradation caused by inhibition of the enzymatic activity of MMPs and an inhibitory effect on VEGF-induced angiogenesis. This study provided overview for EW-7273 and EW-7197 about the effects in vivo and in vitro, the effects on angiogenesis and the interaction of cells surrounding the cancer cells. Thus, EW-7197 and EW-7273 are noted as effective anti-cancer drugs to inhibit cancer metastasis and angiogenesis.