Optimization of experimental condition to study circadian rhythms of Peroxiredoxin Ⅱ hyperoxidation in mouse red blood cells

Abstract

Circadian rhythms are ubiquitous in invariant organisms from cyanobacteria to human. Circadian rhythms have been known to be based on transcription-translation feedback loop1. However, circadian rhythms of Peroxiredoxin2 (Prx2) oxidation were observed in human red blood cell (RBC) recently2. Because RBCs in mammals lack capability of transcription, it reveals post-translational mechanisms are sufficient to sustain circadian timekeeping. We investigated whether circadian rhythms of Prx2 oxidation occurred in mouse RBCs, because the genes related to circadian rhythm in mouse RBCs can be knocked out for studies on underlying mechanisms of the circadian rhythm, unlike human RBCs. But, although we referred to the previous study2, mouse RBCs were hemolyzed too rapid to observe circadian rhythms because of shorter lifespan of mouse RBC than human RBC. In consequence of this problem, we were interested to investigate the appropriate conditions which optimized the survival and circadian rhythms of mouse RBCs. We established the condition (media, serum, temperature, the number of cells per unit volume of media and culture containers) for mouse RBC culture which paved the way to the observation and detection of circadian rhythms on these cells. In this study, we demonstrated that reproducible circadian rhythms patterns of mouse RBCs were observed when 1.5 x 107 mouse RBCs re-suspended in 50 ul DMEM (with 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine, 110 mg/L sodium pyruvate) supplemented with FBS and dispensed into 1.5 ml tubes and kept under constant conditions of temperature and light (at 37 ℃, complete darkness).;생체시계는 박테리아로부터 사람에 이르기까지 모든 생물들이 보유하고 있는 특징이다. 지금까지 생체시계는 유전자의 전사-번역 피드백 고리를 통해서 작동한다고 알려져 왔다. 하지만, 최근 사람의 적혈구에서 Peroxiredoxin2 (Prx2)의 산화 정도가 생체시계의 특징을 가진다는 것이 밝혀졌다. 포유류의 적혈구는 핵이 없어, 전사를 할 수 없다. 이는 곧 전사 후의 작용이 생체시계가 일정주기로 유지되는 원인으로 충분하다는 것을 의미한다. 우리는 쥐의 적혈구도 생체시계를 가지고 있는지 조사하였다. 사람과 달리, 쥐는 여러 가지 유전자를 knock-out 시킬 수 있다. 따라서, 생체시계와 관련된 유전자를 knock-out 시킨 쥐의 적혈구를 통해, 생체시계를 작용시키는 원리를 연구할 수 있다. 그러나, 사람의 적혈구를 사용한 이전 연구 방법을 참고하였음에도 불구하고, 사람의 적혈구보다 수명이 짧은 쥐의 적혈구는 생체시계를 관찰하기에 너무 빨리 용혈 되었다. 이러한 이유로, 우리는 쥐의 적혈구의 생체시계를 관찰할 수 있는 배양액, 혈청, 온도, 배양액 양 대비 세포의 수, 배양 용기의 배양조건을 정립하였다. 이 연구를 통해, 우리는 1.5 x 107 개의 쥐의 적혈구를 50 ul의 sodium pyruvate를 포함하는 DMEM 배양액에 풀어, 1.5 ml tube에 담고, 37 ℃ 에서 빛이 완전히 차단된 채로 배양했을 때, 쥐의 적혈구의 생체시계를 관찰할 수 있다는 것을 보였다.