The role of Wnt signaling in peripheral T/B lymphocyte differentiation

Abstract

면역학적 기억현상의 정의는 신체가 같은 항원에 재노출되는 경우, 더욱 빠르고 강한 면역 반응을 유도하는 것이다. Memory T 임파구의 항상성은 생존, 사멸, 분열을 조율함으로써 pool이 일정 수준으로 유지된다. Memory T 임파구가 면역 반응이 일어나는 동안 어떠한 기작에 의해 형성되는지에 관한 연구는 진행단계에 있다. 분열하지 않고 제한된 수명을 가지는 naïve T 임파구와 달리, memory T 임파구는 수명이 길고 자가생성능력을 가지는 것으로 생각된다. Memory T 임파구의 분열하고 생존할 때에는 항원/MHC 복합체가 아닌, IL-15, IL-7 같은 cytokine이 중요한 것으로 알려져 있다. 그러나 memory T 임파구의 생성과 유지에는 아직 정의되지 않았지만 다른 요인이 필요할 것으로 생각된다. Wnt 단백질은 세포생존과 세포분열을 조절함으로써 세포의 운명을 결정한다. 또한, Wnt 단백질은 조혈모 세포의 자가생성능력을 조절하는 인자이다. 첫째 장에서, 자가생성능력을 가질 것으로 생각되는 memory CD8+ T 임파구 생성에 Wnt 신호가 관여하는지를 조사하였다. 먼저, memory CD8+ T 임파구에서 Wnt 신호가 활성화되어 있는지 조사하였다. 활성화된 Wnt 신호의 표지인 β-catenin을 발현하는 세포의 빈도가 memory CD8+ T 임파구에서 증가되었음을 확인하였으며, Wnt 신호의 타겟 유전자로 알려진 AXIN2의 전사수준 또한 증가되어있음을 확인하였다. 이러한 결과는 Wnt 신호가 memory CD8+ T 임파구에서 활성화 되어있음을 시사하며, Wnt 신호가 memory T 임파구 생성과 유지에 관여할 가능성을 제시한다. 위의 가능성을 확인하기 위하여 effector에서 memory CD8+ T 임파구로 분화되는 동안 Wnt 신호를 방해하였다. LCMV의 gp33-41 펩타이드를 인지하는 T 임파구 수용체를 발현하는 P14 형질전환 생쥐에서 CD8 T 임파구를 분리한후, wild type 생쥐에 adoptive transfer하고 LCMV로 감염시켰다. Wnt와 Wnt 수용체 단백질인, Frizzled 결합을 방해하는 CRD-IgG 융합 단백질을 감염후 8일째부터 60일째까지 생쥐에 주입한후 LCMV 특이적인 memory CD8+ T 임파구의 빈도를 조사하였다. CRD-IgG 처리된 생쥐에서, LCMV 특이적 memory CD8+ T 임파구가 감소된 것을 확인하였으며 이는 Wnt 신호가 memory CD8+ T 임파구 생성에 필요함을 시사한다. 또한, Granzyme B 프로모터에 의해 Wnt 신호 저해 단백질인 AXIN을 발현하는 transgenic mice와 P14 mice를 cross한 후, F1 세대에서 CD8 T 임파구 분리후, wild type mice에 adoptive transfer하였다. LCMV 감염후, 60일째 memory CD8+ T 임파구 빈도가 Granzyme B-AXIN transgenic CD8 T 임파구를 transfer한 mice에서 감소된 것을 확인하여 Wnt 신호가 memory CD8+ T 임파구 생성에 필요함을 다시 한번 증명하였다. 더불어, memory CD8+ T 임파구에서 Wnt 단백질 수용체인 Frizzled와 LRP의 발현이 증가되어있음을 관찰하였고, 이는 memory CD8+ T 임파구가 Wnt 신호에 반응할 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, memory CD8+ T 임파구 자체에서 Wnt 단백질의 발현이 증가되어있었으며, 이는 memory T 임파구에서 생성된 Wnt가 autocrine 모드로 작용할 가능성을 시사한다. 이러한 결과들로 볼 때 Wnt 단백질이 memory CD8+ T 임파구 생성에 중요한 조절인자라는 것을 예측할 수 있다. 다음 장에서는, 항원에 노출되어 B 임파구가 활성화되고 분화할 때, Wnt 신호의 역할을 규명하였다. B 임파구 발생시 Wnt 신호의 기능에 관해 상반된 결과가 발표되었다. Wnt 신호의 downstream 전사인자로 알려진 LEF1는 pro-B 임파구의 생존과 분열에 중요하다고 알려져 있으며, Wnt 신호의 수용체인 Frizzled 9 또한 pre-B 세포의 분열을 조절하여 mature B 임파구의 발생에 기여한다고 보고되었다. 그러나 β-catenin 결핍 mice의 경우 B 임파구 발생이 정상인 것으로 보고되었다. 위의 저자들은 이러한 차이를 γ-catenin 보상작용 혹은 β-catenin이 관여하지 않는 non-canonical Wnt 경로의 활성화 때문일 것이라고 예측하였다. 현재까지, 항원에 노출된 이후 B 임파구 분화시 Wnt 신호의 역할은 밝혀진 바가 없다. T 임파구 의존적 항원 투여후, B 임파구가 분화하는 동안 Wnt 단백질과 수용체의 결합을 방해하는 CRD-IgG를 mice에 투여하였다. T 임파구 의존적 항원 투여후, CRD-IgG 처리된 mice에서 plasma 세포의 세포사멸이 증가됨으로써 3주째부터 IgG1 수준이 감소되었다. 그리고 항원투여 6주 후, CRD-IgG 처리된 경우, spleen의 memory B 임파구 수준은 정상이었지만 bone marrow의 long-lived plasma cell의 빈도는 감소되었다. 이러한 결과는 Wnt 신호가 plasma cell의 생존에 필요하며 이것이 bone marrow의 long-lived plasma cell 생성으로 이어진다는 것을 시사한다. 다음 장에서는, BTB-ZF 단백질군에 속하는 새로운 단백질, BZEL의 기능을 고찰하였다. BTB-ZF 단백질은 DNA 서열을 특이적으로 인지하는 전사인자로 작용한다. BTB-ZF 단백질은 ZF 도메인을 통해 DNA에 결합하고, BTB 도메인을 통해 NcoR, BcoR, SMRT 같은 co-repressor와 결합한다. BTB-ZF 단백질군에 속하는 BCL6는 memory T 임파구 형성에 중요한 전사인자이다. 그러나 BCL6 결핍은 memory T 임파구의 부분적인 감소를 보였으며, 이는 BCL6 결핍을 보상하는 다른 BTB-ZF 단백질이 존재할 가능성을 시사한다. 본 실험실에서는, memory CD8+ T 임파구 cDNA를 사용하여 BTB 도메인의 conserved 서열을 가진 primer를 이용, degenerate PCR을 수행하였으며, 이를 통해 새로운 BTB-ZF 단백질인 BZEL을 발굴하였다. 본 연구실에서는 BZEL이 활성화된 T 임파구에서 발현되는 것을 확인하여, BZEL의 B 임파구 발현양상과 기능에 대하여 조사하였다. BZEL은 B 임파구 활성화 신호, BCR, anti-CD40+IL-4, LPS에 의해 발현이 유도되며 germinal center 유래 B 임파구에서 발현이 높은 것으로 확인되었다. BCL6는 germinal center B 세포에서 발현이 높으며, plasma 세포의 분화에 필수적이라고 알려진 Blimp1의 전사를 억제하여 GC B 세포가 plasma 세포로 분화하는 것을 저해한다. BZEL 또한 germinal center 유래 B 세포주에서 발현이 높으므로, BCL6같이 Blimp1의 발현을 억제하는지 검증하였다. Blimp1 프로부터 부위의 2kb에 의해 조절되는 luciferase reporter 활성은 BZEL에 의해 저해되었으며, ChIP assay를 수행하여 BZEL이 Blimp1의 프로모터 부위에 결합함을 확인하였다. 또한, Primary B 임파구 분리후, BZEL 발현 retrovirus로 transduction한 경우에 plasma cell로의 분화가 저해되었으며 그에 따라 plasma 세포가 분비하는 immunoglobulin 수준도 감소되었다. 이를 통해 BZEL이 Blimp1의 발현을 억제함으로써 plasma cell로의 분화를 저해함을 규명하였다.;Part I. Immunological memory can be defined as a faster and stronger response of an animal following re-exposure to the same antigen. Since homeostasis of memory T cells is regulated by a balance between the cell survival, death, and proliferation, the pool of memory T cells remains stable in the body. How and when memory T cells form during an immune response are still long-standing questions. In contrast to naïve T cells, which do not divide and have limited lifespan, memory T cells have long lifespan and self-renewal capacity with intermittent proliferation. It is known that TCR engagement with antigen/MHC molecules is not required for the turnover and survival of memory T cells, whereas, cytokines, such as IL-15 and IL-7, play certain roles in memory T cell maintenance. However, the cytokine signaling is not sufficient and other factors that are not yet defined, may play a role in the generation and maintenance of memory T cell pool. Wnt proteins decide cell fate by regulating cell death and proliferation. Moreover, Wnt proteins act as a regulator of hematopoietic stem cell self-renewal. Since CD8+ memory T cells are thought to have self-renewal property, I was interested in the possibility whether Wnt signaling is involved in the generation of CD8+ memory T cells. Here, I have shown that the frequency of cells positive for the β-catenin expression, a marker of activated Wnt signaling, was significantly elevated in CD8+ memory T cells generated in vivo compared to naïve T cells. Consistent with this, the expression of AXIN2, a target gene of Wnt signaling, was specifically elevated in memory CD8+ T cells. These results show that Wnt signaling is activated in memory CD8+ T cells and raises a possibility that Wnt signal is involved in the generation and/or maintenance of memory CD8+ T cells. To test this possibility, the effects of the inhibition of Wnt signal during effector-to-memory transition were tested. CD8+ T cells of LCMV (Lymphocytic choriomeningitis) gp33-41-specific P14 TCR transgenic mice were adoptively transferred to wild type mice, and the recipient mice were infected with LCMV. Starting from day 8 post-infection (p.i.), mice were injected with CRD-IgG 2-3 times/week for up to 60 p.i. to inhibit the Wnt-Frizzled receptor binding. In these CRD-IgG-treated mice, the frequency of gp33-41 H-2Db tetramer+CD8+ memory T cells was significantly reduced compared to that of control IgG-treated mice showing that Wnt signal is required for the generation of memory CD8+ T cells. The involvement of Wnt signal in the generation of memory CD8+ T cells was further confirmed using the transgenic mice expressing AXIN, an inhibitor protein of Wnt signal, under the control of granzyme B promoter. P14 mice and granzyme B promoter-AXIN transgenic mice were crossed and from F1 progeny, CD8+ T cells were isolated and transferred to wild type mice. The recipient mice were infected with LCMV and at day 60 p.i., the frequency of gp33-41 H-2Db tetramer+CD8+ memory T cells was analyzed and found to be significantly lower compared to that of control confirming that Wnt signal is required for the generation of memory CD8+ T cells. In addition, the expression of Frizzled receptors was elevated in memory CD8+ T cells compared to that of naïve T cells, which may confer the sensitivity to Wnt signal on memory CD8+ T cells. Interestingly, the expression of Wnt proteins itself is elevated in memory CD8+ T cells suggesting that Wnt proteins produced by memory CD8+ T cells may act in an autocrine mode. Taken together, my results suggest that Wnt signaling is a key regulator for the generation of memory CD8+ T cells. Part II. There has been a controversy about the involvement of Wnt signal in B cell development. LEF1, the down-stream transcription factor of Wnt signaling, was shown to be important in maintaining survival and proliferation of pro-B cells. Frizzled 9, a receptor of Wnt proteins, regulates the proliferation of pre-B cells that leads to development into mature B cell. However, in β-catenin-deficient mice, lymphopoiesis and the development of peripheral B cells were found to be normal. The observed discrepancy was attributed to the possible compensation by γ-catenin or to the intact non-canonical pathway in β-catenin-deficient mice. Moreover, until now, the function of Wnt signaling during the differentiation of peripheral B cells has not been addressed. Therefore, in this chapter, I tested the effect of Wnt antagonist, CRD-IgG, an inhibitor of binding between Wnt and Frizzled receptor, during immune response against T-dependent-antigen. I blocked the Wnt signaling during B cell differentiation. I found that from 3 weeks after immunization, IgG1 level, but not IgM level, in serum was significantly reduced in CRD-IgG-treated mice and this was due to the increased apoptosis of plasma cells. Moreover, at 6 week after immunization, the frequency of long-lived plasma cells in bone marrow, but not the memory B cells, was significantly reduced by CRD-IgG treatment. These results may suggest that Wnt signaling is required for the survival of plasma cells and thereby for the generation of long-lived plasma cells in bone marrow. Part III. BTB-zinc finger (BTB-ZF) proteins act as a sequence-specific transcriptional repressor. BTB-ZF proteins bind to DNA in a sequence-specific manner through zinc-finger domain and interact with co-repressor, such as NcoR, BcoR and SMRT, through BTB domain. BCL6, a BTB-ZF protein, has been shown to be important for the generation of memory CD8+ T cells. However, BCL6 deficiency do not lead to a complete loss of memory CD8+ T cells, which suggests that other BTB-ZF proteins may compensate for the BCL6-deficiency. Therefore, in our lab, using cDNA from memory CD8+ T cells as a template, PCR was performed by using degenerate primer of BTB-domain, and as a result, a novel BTB-ZF protein, BZEL (BTB-ZF proteins expressed in effector/memory lymphocytes) was identified. As BZEL is expressed in T lymphocytes, I investigated a possibility that BZEL is also expressed in B lymphocytes and involved in B cell differentiation or function. I found that BZEL expression was induced by B cell stimulation signals such as BCR, anti-CD40+IL-4 and LPS in primary B cells and BZEL was highly expressed in germinal center derived-B cell lines. As BCL6 is known to repress Blimp1 expression in germinal center B cells, I tested whether BZEL also represses the Blimp1 expression. The luciferase reporter activity controlled by the 2.0 kb of Blimp1 promoter was repressed by the co-expression of BZEL. By performing ChIP assay, I also found that BZEL bound to Blimp1 promoter. Moreover, in primary B cells transduced with retrovirus expressing BZEL, the differentiation into plasma cells and immunoglobulin secretion were significantly reduced. These results may suggest that BZEL, a novel BTB-zinc finger protein, negatively regulates the B cell differentiation into plasma cells by repressing the expression of Blimp1.