IN-2001, HDAC 억제제에 의한 유방암의 폐 전이 억제 작용 연구

Abstract

Breast cancer is the major cancer in female around the world. In previous study, histone deacetylase (HDAC) inhibitor, IN-2001 was proved that inhibit tumor growth inbreast cancers. Metastasis is critical point of cancer patient’s prognosis and directly related to death. So, we paid attention to anti-metastatic effect of IN-2001 and tried to find out mechanism of IN-2001. In this study, we examined a mechanism of IN-2001 in breast cancer cells (MCF7, MDA-MB-231) in vitro and MMTV/c-Neu transgenic mice invivo. In MCF7 and MDA-MB-231 breast cancer cells, IN-2001 decreased cell migration in a wound healing assay and changed genes related to TGF-β signaling (TGF- β1, TGF- βR1, Smad7), epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers (E-cadherin, N-cadherin) and matrix metalloproteinases (MMPs; MMP-2, MMP-9). IN-2001 did not change TGF- β1 and TGF- βR1 mRNA levels, but TGF- βR1 protein was decreased by IN-2001 treatment with dose-dependent manner in MCF7 and MDA-MB-231. In MDA-MB-231 cells, Smad7 and E-cadherin protein were increased and not changed N-cadherin, MMP-2 and MMP-9 mRNA. But N-cadherin, MMP-2 and MMP-9 mRNA were increased by IN-2001 in ER positive breast cancer cells, MCF7. We examined the ability of anti-angiogenic effect of IN-2001 by tube formation assay with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in vitro. As a result, IN-2001 effectively inhibited tube formations. This phenomenon was closely related to decrease of angiogenesis regulators, such as VEGF, pDGF, CD31 in human breast cancer cells, MCF7 and MDA-MB-231. We examined in vivo effects of IN-2001 in MMTV/c-Neu transgenic mice. Smad7 and E-cadherin were increased, and MMP-2, MMP-9 and VEGF were decreased. According to these results, we suggest that IN-2001 inhibits metastasis and angiogenesis of tumor. We developed our studies for comprehensive nderstanding the effects of IN-2001 in vivo systems and analyzed gene expression profiles of MMTV/c-Neu transgenic mice and MDA-MB-231 xenografted nude mice by microarray. According to differentially expressed genes (DEGs) analysis of MMTV/c-Neu transgenic mice, IN-2001 changed genes related to existence of normal cells, such as fundamental cell signaling, metabolism and osmotic pressure. Because genes are never act alone and are working in a cascade of network in biological system, we proceeded to pathway analysis of DEGs. As a result, IN-2001 significantly affected to mRNA transcription regulation pathway and the pathway had up-regulated DEGs more than down-regulated DEGs. In addition, IN-2001 changed pathways that related to primary solid tumor growth (cell proliferation and differentiation pathway, cell cycle pathway, apoptosis pathway) and tumor metastasis (cell structure and motility pathway, cell adhesion molecule pathway). In the analysis of MDA-MB-231 xenografted nude mice used by same microarray methods, we identified that IN-2001 changed genes related to acute-inflammation and muscle mobility. In pathway analysis, IN-2001 significantly affects to mRNA transcription regulation pathway like analysis of MMTV/c-Neu transgenic mice. And IN-2001 changed pathways related to primary solid tumor growth (cell proliferation and differentiation pathway) and tumor metastasis (cell structure and motility pathway) in MDA-MB-231 xenografted nude mice. We identified common DEGs in MMTV/c-Neu transgenic mice and MDAMB- 231 xenografted nude mice, but the number of DEGs was not sufficient to analysis and leading to mean. According to our microarray study, we expected that IN-2001 change tumor growth and migration in biological system of breast cancer patients. Taken together, our data suggest that this HDAC inhibitor, IN-2001, inhibits metastasis in human breast cancer cells (MCF7 and MDA-MB-231) and MMTV/c-Neu transgenicmice. Especially, IN-2001 represented remarkable anti-angiogenic effect which is recently spotlighted as HDAC inhibitor’s new mechanism of anti-cancer. Throughdeveloping our findings, we can expect that IN-2001 will be a promising therapeutic agent with anti-tumor effects against human breast cancers. In addition, we suggest that combination-therapies between anti-angiogenic agents or anti-metastatic agents are effective strategy for metastatic breast cancers.;유방암은 전 세계적으로 가장 흔히 발생하는 여성암이다. 유방암 치료의 목적으로 개발되었던 신규 히스톤 탈아세틸화효소 억제제인 IN-2001은 암의 성장을 억제하는 효과가 앞선 연구에서 입증되었다. 암의 전이는 암 환자의 예후에 악영향을 미치는 가장 큰 요인이며, 사망과 직접적인 연관성을 갖는다. 따라서, IN-2001이 유방암의 전이에 미치는 효과를 새롭게 주목하여 암 전이 억제능과 그 작용기전을 연구하였다. 이 연구에서는 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐와 에스트로겐 수용체 양성 사람 유방암 세포주인 MCF7, 에스트로겐 수용체 음성 사람 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 통해 HDAC inhibitor의 유방암 전이 억제 작용을 시험하였다. IN-2001은 사람 유방암 세포주인 MCF7과 MDA-MB-231에서 세포 이동성 억제 효과를 나타냈으며, TGF-β signaling 관련 유전자(TGF-β1, TGF-βR1, Smad7)와 Epithelial-mesenchymal transition 지표(E-cadherin, N-cadherin), Matrix metalloproteinases (MMPs; MMP-2, MMP-9) 를 변화시켰다. MCF7과 MDA-MB-231에서 IN-2001에 의한 TGF-β1, TGF-βR1의 mRNA 변화는 뚜렷하지 않았으나, IN-2001의 농도가 증가함에 따라 TGF-βR1 단백질이 감소하였다. 에스트로겐 수용체 음성 사람 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포에서 Smad7과 E-cadherin 단백질의 증가가 나타났으며, N-cadherin, MMP-2, MMP-9의 mRNA 변화는 나타나지 않았다. 에스트로겐 수용체 양성 사람 유방암 세포인 MCF7에서는 N-cadherin, MMP-2, MMP-9의 mRNA가 증가하였다. IN-2001은 human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)을 이용한 in vitro tube formation assay에서 신생혈관 형성 억제 작용을 나타냈다. 혈관형성 관련 유전자들(VEGF, pDGF, CD31)의 mRNA 및 단백질 변화를 사람 유방암 세포주(MCF7, MDA-MB-231)에서 확인한 결과 IN-2001에 의해 감소하여, 신생혈관 형성 억제 효능을 확인할 수 있었다. IN-2001의 생체 내 효과를 확인하기 위해 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐를 이용하여 실험하였으며, Smad7과 E-cadherin의 mRNA와 단백질이 증가하였다. 또한, MMP-2와 MMP-9 mRNA가 감소하였고, VEGF의 mRNA와 단백질이 감소하여 IN-2001에 의한 전이 및 신생혈관 형성 효능을 확인할 수 있었다. IN-2001의 생체 내 작용에 대한 포괄적 연구를 위해 microarray 방법을 이용한 유전자 프로파일 분석을 실시하였다. c-Neu 유전자 발현을 통해 정상 유방 상피 세포를 악성 유방 종양으로 변화시킨 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐와 전이성이 입증된 사람 유방암 세포주 MDA-MB-231를 이종 이식한 면역 억제 생쥐의 유전자 변화를 비교 분석하였다. MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐의 유의 유전자 변화 분석 결과를 통해, IN-2001에 의해 암 세포 특이적이기 보다는 모든 세포에서 세포의 생존, 성장에 관여하는 기본적인 신호전달, 대사, 삼투압과 관련된 유전자들이 조절됨을 알 수 있었다. 생체 내에서는 모든 유전자들이 일련의 네트워크를 형성하여 작용하기 때문에 개별 유전자 분석에 이어 pathway 분석을 진행하였다. 그 결과, IN-2001에 의해 가장 큰 영향을 받는 pathway는 mRNA transcription regulation pathway 이었으며, 암 조직에서 up regulation된 유전자 수가 down regulation 된 유전자 수보다 많았다. 또한, 1차 고형암 성장과 관련된 pathway들(cell proliferation and differentiation pathway, cell cycle pathway, apoptosis pathway)과 암 전이와 관련된 pathway들(cell structure and motility pathway, cell adhesion molecule pathway)이 많은 변화를 보여, IN-2001이 암 성장과 전이에 관여함을 확인할 수 있었다. MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐와 동일한 방법으로 분석을 진행했을 때, 전이성이 입증된 사람 유방암 세포주 MDA-MB-231를 이종 이식한 면역 억제 생쥐에서는 급성 염증 반응 및 근 움직임과 관련된 유전자 변화가 현저하게 나타났다. Pathway 분석에서는, MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐와 마찬가지로 mRNA transcription regulation pathway가 IN-2001에 의해 조절된 유의 유전자 수가 가장 많은 pathway로 나타났고, 1차 고형암 성장에 관한 pathway(proliferation and differentiation pathway )와 암 전이에 관한 pathway(cell structure and motility pathway)가 나타났다. MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐와 MDA-MB-231 세포를 이종 이식한 면역억제 생쥐에서 공통으로 검출된 유의 유전자를 선별하여 연구를 발전시켰으나, 공통 유의 유전자 수가 적어 의미를 도출하지 못했다. 두 동물 모델의 결과를 종합하면, IN-2001이 유방암 환자의 생체 내에서 암 세포 성장과 이동성을 변화시키고, 암 전이에 영향을 미칠 것을 예상할 수 있다. 이상의 결과들로부터, HDAC inhibitor인 IN-2001은 사람 유방암 세포주인 MCF7, MDA-MB-231와 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐에서 암 전이 억제 효능을 나타냄을 제안할 수 있다. 특히, 최근 HDAC inhibitor의 새로운 작용으로 각광받고 있는 신생혈관 형성 억제 작용에 대한 IN-2001의 효과가 주목할 만 하다. IN-2001의 신생혈관 형성 억제 작용에 대해 추후 더 깊은 연구로 발전시킨다면 IN-2001은 유방암 치료에 유망한 물질이 될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, IN-2001와 신생혈관 형성 억제제 또는 전이 억제제의 병용 투여에 대한 연구를 발전시킨다면 새로운 유방암 치료법으로 이용될 수 있을 것이다.