Toxicolkinetics and Inflammatory Responses of Manufactured Nanoparticles

Abstract

Many approaches for the application of nano-sized particles to the human body as nanotechnology have been recently developed. The chemical properties, surface character, administration rout and size of nanoparticles are related to their useful character and biodistribution and also play a key role in toxicity. PART 1 of this study demonstrated the acute toxicity and kinetic profile of Cy5.5-conjugated iron oxide nanoparticles and chitosan nanoparticles in mice with intratracheal instillation and also compared kinetic profile of iron oxide nanoparticles with intravenous injection. Cy5.5-conjugated iron oxide nanoparticles slightly induced pulmonary inflammation. The instilled nanoparticles were distributed mainly in the lung and excreted in the urine via glomerular filtration. Excretion in the urine was peaked at 3 h after instillation. No toxicities were found under the concentration of 1.8 mg/kg of iron oxide nanoparticles and the half-lives of nanoparticles in the lung and urine was estimated to be 14.4 ± 0.54 h and 24.7 ± 1.02 h, respectively. The other side, the intravenous injected FITC-conjugated iron oxide nanoparticles was mainly distributed in liver and residue was confirmed by CLSM. The half-lives of injected iron oxide nanoparticles nanoparticles in the plasma was estimated to be 2.8 ± 1.2 h. Intravenous injection of nanoparticles enters directly into systemic circulation. In addition, intraperitoneally injected nanoparticles would be taken up by the liver via first-pass. Therefore, organs containing large number of macrophages, which are part of the RES, are main target for intravenous or intraperitoneal injection of nanoparticles. However, nanoparticles exposed by inhalation or instillation would avoid direct systemic circulation and bypass such liver-related first-pass effect. Nanoparticles evading phagocytosis by alveolar macrophages may also evade phagocytosis by macrophages of other organs such as liver, spleen, lymph node and bone marrow. chitosan nanoparticles entered rapidly into systemic circulation and were distributed to several organs, including liver, kidney, spleen, heart, salivary gland, mesenteric lymph node, accessory sex gland, testis, and brain. Accumulation of chitosan nanoparticles was transient and mainly localized in reticuloendothelial organs, such as liver, spleen, and kidney, which are responsible for nanoparticle elimination. Chitosan nanoparticles were excreted via urine slower than Cy5.5-conjugated iron oxide nanoparticles, and peaked at 6 h after instillation. chitosan nanoparticles induced transient pulmonary inflammation from 6 h to 3 days after instillation. Thease results correlated with that chitosan nanoparticles have longer residual time in lung than Cy5.5 conjugated iron oxide nanoparticles. Half-life of chitosan nanoparticles in lung was estimated as 131.97 ± 50.51 h and this is about 9 times of Cy5.5-conjugated iron oxide nanoparticles and half life in plasma was estimated as 42.01 ± 35.33 h. But half life in urin (16.63 ± 6.34) is shorter than Cy5.5-conjugated iron oxide nanoparticles. This is considered as results of chitosan nanoparticles have accumulation property in liver and spleen. Although further studies are required, our results showed that Cy5.5-conjugated-iron oxide nanoparticles and chitosan nanoparticles can be a good candidate for use in a pulmonary delivery vehicle and as diagnostic probes. In the PART 2, we compared the distribution and excretion of three different PEG coated gold nanoparticles and silica nanoparticles after intravenous injection into mice. Gold nanoparticles can be used in various biomedical applications, however, very little is known about the size-dependent in vivo kinetics. Here, we carried out kinetic study with different sizes of PEG-coated AuNPs (AuNPs). AuNPs of 4, 13 nm were sustained high until 24 h and cleared by 7 d in blood whereas 100 nm AuNPs were completely cleared by 24 h. In AuNPs of 4, 13 nm groups, the highest concentration was at 7 d in liver and spleen and at 1 month in mesenteric lymph node. In contrast, 100 nm AuNPs in liver, spleen and mesenteric lymph node were taken up rapidly (~ 30 min) without elimination. TEM image showed that AuNPs were entrapped in cytoplasmic vesicles and lysosomes of Kupffer cells and macrophages of spleen, and mesenteric lymph node. These nanoparticles seem to be eliminated via bile and urine, but quantities were extremely low compared with those of liver and spleen. AuNPs of 4, 13 nm activated the CYP1A1 and 2B, representative phase I metabolic enzymes. The effects on CYP1A1, 2B were transient from 1 to 7 d and well correlated with pattern of gold concentration in the liver. However, 100 nm AuNPs did not affect the metabolizing enzymes. Intravenous injection of nanoparticles directly enters blood circulation. PBMC was used the as a model system to study in vitro responses of gold nanoparticles. The induction of cytokines by mononuclear cells in vitro has been used to assess the effects of ambient and occupational particles. Cytokine are major factor in the initiation and regulation of immune response and allergic and infectious inflammatory responses. This study measured proloiferation and the release of the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 and TNF-α by human peripheral blood mononuclear cells treated with 4, 13 and 100 nm-sized gold particle suspension. It has been demonstrated that 100 nm particles induced proliferation less and TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 and IL-10 far more than 4 and 13 nm. The fluorescence dye-labeled 50, 100 and 200 nm-sized silica particle suspension was intravenously injected into mice to identify the toxicity, tissue distribution and excretion of silica nanoparticles in vivo. Histopathologically, the incidence of transient inflammation in the liver was significantly increased with injection of 200 nm silica particles. The silica nanoparticles were cleared via urine and bile. Smaller particles existed in urine and feces at higher concentrations and cleared more rapidly via bile than larger particles. 200 nm silica nanoparticles trapped more rapidly in liver than 50 and 100 nm. These results correspond with that 100 nm AuNPs in liver, spleen and mesenteric lymph node were taken up rapidly. Silica nanoparticles were trapped by macrophages in the spleen and liver and remained there until 4 weeks after the single injection. It has been demonstrated that the distribution and excretion of three different silica nanoparticles and gold nanoparticles of varying particle size after intravenous injection into mice. This study indicates that AuNPs are accumulated in the reticuloendothelial organs, hardly be eliminated while activating phase I metabolic enzyme and induced proinflammatory cytokine in vitro. As particle sizes increased, more silica nanoparticles were trapped by macrophages. In addition, the silica nanoparticles were cleared via urine and bile. Smaller particles exist in the urine and feces at higher concentrations and are cleared rapidly.;Part I. 폐장을 통한 약물투여 경로는 폐질환뿐만 아니라, 전신순환을 위해서도 고려되고 있으며, 폐장으로 약물을 전달하는데 활용하는 전달체의 선택은 중요한 요소 중의 하나이다. 최근 나노기술의 발전으로 폐장으로 약물 또는 유전자를 전달할수 있는 정밀한 전달체의 개발이 가능하게 되었다. 산화철나노입자는 체내에서 자기공명 촬영을 통해 영상화를 가능하게 하며, 외부 자기장을 이용하여 대상 부위로 물질을 이동시킬 수 있으며, 암치료를 위한 열치료를 할 수 있다는 다양한 장점이 있다. 키토산은 물질의 생체적합성, 항미생물성, 생분해성등으로 인해 다양하게 활용되고 있으며, 특히 키토산 나노입자를 이용한 항암제 및 유전자 치료를 위한 새로운 DDS 방법이 보고되고 있다. 최근 개발되고 있는 금속과 비금속 나노물질은 영상과 치료분야에 크게 활용할 수 있다는 장점이 있으나, 독성을 유발할 가능성이 있다는 점이 큰 우려를 낳고 있다. 본 연구에서는 형광 물질을 결합한 산화철 나노입자와 키토산 나노입자를 폐장으로 투여하여 급성 폐장 독성과 생체내 분포 및 배설을 조사하고, 물질특성에 따른 생체분포 및 독성반응을 비교하였으며, 산화철 나노입자를 폐장투여와 정맥투여에 따른 생체분포를 비교하였다. 약 35nm 크기의 음전하를 띈 산화철입자를 마우스 경기관지로 투여하였을 때, 기관지로 투여된 산화철 나노입자는 약간의 폐장염증반응을 유도하였으며, 투여된 입자는 주로 폐장에 분포하였고 사구체여과를 통하여 뇨로 배설되었다. 뇨중 배설은 3시간에서 최고치를 보였으며, 1.8mg/kg 이하의 농도로 투여한 그룹에서는 독성반응이 나타나지 않았다. 폐장과 뇨에서의 반감기는 약 14.4시간과 24.7시간을 나타났다. 반면 정맥으로 투여된 산화철 나노입자는 주로 간에 분포하였으며, 혈중반감가는 약 2.8시간으로 나타났다. 약 350nm 크기의 양전하를 띈 키토산 나노입자를 마우스 경기관지로 투여하였을 때, 기관지로 투여된 키토산 나노입자는 일시적으로 약간의 폐장염증반응을 유도하였다. 생체내 분포를 조사한 결과, 산화철나노입자와는 다르게 투여된 나노입자가 간과 비장, 신장등 전신으로 분포하며, 사구체여과를 통하여 뇨로 배설되었다. 뇨중 배설은 6시간에서 최고치를 보였으며. 폐장반감기는 약 131.9시간으로 나타나 비교적 길게 나타났다. 향후 추가적인 연구가 필요하지만, 본연구결과 형광 산화철 나노물질과 키토산나노물질은 폐장투여를 위한 약물전달체로 좋은 후보물질이라고 사료된다. Part II. 최근에는 나노기술이 많이 발전하여 화장품 등의 성분의 효과적인 전달을 위하여 나노 크기로 제작된 약물 및 화장품성분이 많이 등장하고 있다. 그러나 아직 나노 크기의 입자에 대한 체내 동태 및 독성 등에 대한 연구는 거의 이루어지고 있지 않아 이에 대한 독성시험이 매우 시급한 실정이다. 나노물질이 독성을 유발하는데 그 물질의 성질도 중요하지만 그 크기에 의해서 크게 좌우된다는 연구결과가 있다. 본 실험에서는 입자사이즈에 따른 체내 동태 및 배출의 차이를 규명하고, 이에 따른 독성반응을 살펴보고자 금나노물질 및 실리카나노물질을 각각 3가지 종류의 사이즈로 합성하고 정맥투여후 사이즈에 따른 분포 및 배설, 독성반응을 조사하였다. 금나노물질을 4, 13, 100nm 사이즈로 합성하여 정맥으로 투여하고, 생채내 분포 및 배설, 독성반응을 조사하였다. 4와 13nm 금나노물질은 혈중에서ㅗ 24시간까지 고농도로 존재하였으며 7일째까지 서서히 소실되는 경향을 보였으나, 100nm의 경우 24시간 이내에 혈중에서 소실되었다. 4와 13nm의 경우 7일째에 간과 비장에서 가장높은 농도를 보이고, 이후 서서히 소실되었으며 100nm의 경우는 빠르게 간, 비장, 장관막림프절로 분포된뒤 특별한 소실 패턴 없이 6개월까지 잔존하였다. 전자현미경으로 관찰한 결과 금나노물질은 간의 쿠퍼세포와 비장의 대식세포의 세포질에서 관찰되었다. 정맥으로 투여된 나노물질은 담즙과 뇨로 배설되었으나 간과 비장에서 잔존하는 양과 비교하여 볼 때 배설되는 양은 미미하였다. 4와 13nm 금나노물질은 간에서CYP1A1과 2B 효소를 활성화 시켰으며, 이러한 영향은 투여후 1일에서 7일사이에 나타났다가 사라졌다. 그러나 100nm의 경우 이러한 간 대사효소의 유도는 관찰되지 않았다. 형광염료인 rhodamine-B-isothiocyanate(RITC)를 포함한 실리카나노입자를 사이즈별로 50nm, 100nm, 200nm 사이즈로 제작하고, 이를 마우스에 미정맥 투여하고 생체내 분포 및 배설을 조사하였다. 투여 후 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 1주, 3주, 4주 후 동물을 희생시켜 나노입자의 사이즈에 따른 체내 분포와 체외배출 및 독성반응을 관찰하였다. 형광현미경을을 통하여 조직내 나노입자의 분포를 조사한 결과 간과 비장에 집중적으로 분포하는 것이 관찰되었으며, 나노입자의 혈중농도와 뇨와 대변을 통한 배출을 측정하였는데, 1주째에 입자의 혈중농도는 대조군의 수준으로 떨어졌으나 뇨와 대변에서는 여전히 감지되었다. 50nm 실리카 나노입자는 12시간에서 가장 많이 배출되었으며, 100nm 입자는 24시간에서 가장높은 농도로 배출되는 경향을 보였다. 이상의 결과로 볼 때, 금나노물질과 실리카나노물질의 생체내 분포 및 배설 패턴은 입자의 사이즈와 밀접한 상관성을 가지고 있었으며 약물전달체 및 진단용 나노입자의 선택에 사이즈가 중요한 요소임을 알수 있었다.