Modification of collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2) expression in ischemic condition

Abstract

Collapsin response mediator protein (CRMP)은 신경계 발달을 조절하는 세포질내 단백질로서, 특히 신경돌기가 생성되는 발달 초기 과정 및 microtubule의 운동성을 조절하는 과정에 관여 하는 것으로 알려져 있다. 또한 다양한 인산화 효소에 의하여 인산화된 CRMP 단백질은 세포내 신호 전달 과정에 중요한 역할을 한다. CRMPs 중 가장 많이 발현되어있는 CRMP-2는 특히 신경계 발달 초기와 일부 성숙한 신경계에서 발견되며, 신경세포 내의 growth cone, axon, cell body 등에도 분포하는 것으로 알려져 있다. 알츠하이머, 뇌허혈, 간질등과 같은 신경계 질환 및 신경 독성이 유발되는 병적 상태에서는 CRMP-2의 발현 양상이 변화되는 것이 보고된 바 있다. 이전 2D-MALDI-TOF 연구를 통하여, 뇌허혈을 일으킨 뇌조직에서의 CRMP-2는 정상 조직에서 나타나는 62 kDa의 CRMP-2와 달리, 특이적으로 58 kDa로 절단되어 발현되는 것을 알았다. 또한 뇌허혈 상태와 유사하다고 보고된 저산소증을 유발시킨 세포에서도 저산소 배양 시간이 증가 할수록, 62 kDa 는 감소하는 반면, 새로운 58 kDa CRMP-2의 발현은 증가하는 것이 관찰되었다. 저산소 자극으로 인하여 58kDa CRMP-2가 발견되는 현상은 calpain에 의한 것임이 밝혀졌으나, 변화된 CRMP-2의 생체내 역할은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는, 먼저 58 kDa CRMP- 2의 발현 원인이 되는 다양한 효소들의 역할에 대하여 연구하였으며, 다음으로 CRMP-2의 Thr-514 인산화에 관련되는 PI3K/GSK-3β 신호전달 체계가 허혈 조건하에서 CRMP-2의 인산화를 어떻게 조절하는지, 이러한 인산화 현상이 CRMP-2의 절단현상까지도 조절할 수 있는지 연구하고자 하였다. 또한 calpain에 의하여 절단되는 정확한 위치를 발견하여, 절단된 후의 CRMP-2의 역할 규명을 위한 연구를 수행하고자 하였다. CRMP-2 절단 현상의 원인이 되는 효소를 규명하는 연구 결과, 칼슘의 세포내 진입이 58 kDa의 CRMP-2 생성에 있어 중요한 조절 인자임을 확인하였으며, 이러한 칼슘의 세포내 농도에 따라 그 활성도가 증가하는 calpain에 의해 CRMP-2의 절단 현상이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 허혈시 활성화 되는 대표적 효소로 대두되고 있는 caspase 및 세포내 활성산소 유발시 CRMP-2를 절단하는 것으로 보고된 thrombin은 뇌허혈 상태에서 CRMP-2를 절단하는 원인이 되지 않음을 확인하였다. 이러한 뇌허혈 상태에서는 절단된 58 kDa CRMP-2의 발현 증가 이외에도 정상상태의 62 kDa보다 더 큰 분자량의 CRMP-2가 점차 감소되는 것이 관찰되었다. 이는 CRMP-2의 인산화된 형태일 것으로 예상되어, 뇌허혈 상태에서의 인산화된 CRMP-2의 발현 양상 변화에 대하여 연구하고자 하였다. 먼저 CRMP-2의 특정 부위의 인산화를 감지할 수 있는 항체를 이용하였다. 3F4 항체는 알츠하이머 뇌조직 병변에서 특이적으로 과량 발현되는 인산화된 CRMP-2를 감지할 수 있는 항체로서, 뇌허혈 발생시에는 이 3F4로 감지되는 특정 인산화된 CRMP-2의 변화는 관찰되지 않았다. 다음으로 GSK-3β에 의해 Thr-514번 위치가 특이적으로 인산화된 CRMP-2를 감지할 수 있는 항체를 이용하여 연구를 진행하였다. GSK- 3β는 그 보다 상위단계에서 작용하는 PI3 kinase에 의하여 그 인산화가 조절되는 것이 알려져 있으므로 각각의 저해제를 처리하여 허혈 조건하에서 CRMP-2의 인산화가 조절되는지 여부를 연구하였다. 그 결과 허혈 배양 시간에 따라 PI3K/Akt/GSK-3β 체계에 의한 신호전달 기능이 CRMP-2의 인산화에 있어 시간에 따라 상이한 결과를 나타낸다는 사실을 발견하였다. 즉 단기간의 허혈 시, CRMP-2는 PI3K/GSK-3β 신호전달 체계에 영향을 받으나, 장시간 허혈에 노출되는 경우, 활성화된 calpain이 GSK-3β의 인산화 능력의 손실을 초래하여 CRMP-2의 인산화에 관여하지 않음이 관찰 되었다. CRMP-2의 절단 현상은 이러한 PI3K/GSK-3β pathway의 신호전달에 의한 인산화 정도에 의하여 조절되지 않는 것으로 관찰되었다. 또한, calpain에 의해 인산화된 CRMP-2가 절단된 후에도 CRMP-2는 여전히 인산화된 형태로 남아있기 때문에, 앞선 Mass 분석 결과 및 CRMP- 2를 감지하는 항체의 부위를 고려할 때, calpain에 의해 절단되는 가장 가능성 높은 위치를 예측할 수 있었다. 향후 cleavage CRMP-2 form을 이용하여 뇌졸중과 저산소증 질환에서의 CRMP-2에 대한 기능 연구가 진행되어야 할 것이며 이는 뇌졸중의 병리 기전을 더 명확히 이해하고, 허혈의 원인 규명이나 치료제 개발에 단서를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.;The collapsin response mediator protein-2 (CRMP-2) is cytosolic phosphoprotein which is known to be involved in axonal guidance and neuronal outgrowth in the nervous system. In a previous study, the expression of several proteins has shown to be modified in rat models of focal cerebral ischemia using middle cerebral artery occlusion. Through the two-dimensional poly acryl amide gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorbtion/ionization-time of flight mass spectrometry, it was discovered that CRMP-2 was specifically cleaved into a 58 kDa form in brain tissues of focal cerebral ischemia rat model. It was also observed that similar changes in the expression pattern of CRMP-2 occurred in an in vitro ischemia-mimicking anoxic condition. However, the signal mechanisms that are related to cleavage of CRMP-2 and its physiological functions are not known. In this study, first, it was investigated and confirmed that the 58 kDa CRMP-2 formation was regulated under ischemic condition. Second, it was tried to clarify the relation of phosphorylation and cleavage of CRMP-2 by calpain under ischemic condition in PC12 cells and SH-SY5Y cells. It was examined whether the PI3K/GSK-3β signaling pathway was related to CRMP-2 phosphorylation at Thr-514 and if it could play a role in regulation of CRMP-2 cleavage under ischemic condition. In addition, the cleavage site of CRMP-2 was determined. The cleavage of CRMP-2 was found to be induced by intra-cellular Ca2+ overload. The next step was to examine whether the CRMP-2 cleavage was regulated by several Ca2+-regulated proteases, such as caspase, calpain or thrombin, which are known to be involved in ischemia. It was observed that among these enzymes only calpain produced the cleavage of CRMP-2. Besides the generation of truncated CRMP-2, it was also observed that the expression levels of CRMP-2 with higher molecular weight than 62 kDa were decreased in ischemic condition. It was thought that the decreased band could be the phosphorylated form of CRMP-2. Thus it was first investigated the phosphorylation of CRMP-2 using 3F4 antibody which can detect highly phosphorylated CRMP-2 at Thr-509, Ser-518 and Ser-522 in Alzheimer’ disease (AD) brain, but changed in the phosphorylated CRMP-2 were not examined under ischemic condition. On the other hand, when we performed western blotting with another antibody, anti-phospho CRMP-2 monoclonal antibody which can detect the phosphorylated CRMP-2 at Thr-514 by GSK-3β, changes in the phosphorylation of CRMP-2 were observed. The phosphorylated CRMP-2 at Thr-514 in normoxic condition disappeared at earlier time point than the time point at which the cleavage of CRMP-2 appeared after further ischemic insult. These results raised a possibility that the disappearance of phosphorylated CRMP-2 was due to removal of the phosphorylation sites by cleavage under ischemic condition. However, it was observed that phosphorylated CRMP-2 at Thr- 514 was detected by calpain treatment even after cleavage. Thus we concluded the phosphorylation site at Thr-514 was included in the cleavage form. In addition, further mass analysis and consideration of epitope domain (amino acids 486-528) for anti- CRMP-2 monoclonal antibody suggest that the most probable cleavage site is between Arg-532 and Asn-533. The effects of PI3K/GSK-3β pathway on phosphorylation and cleavage of CRMP-2 expression were also investigated. It is known that GSK-3β activity is regulated by PI3K/Akt/ pathway. It was found that involvement of PI3K/GSK-3β pathway is different according to ischemic period. In early stage of ischemia, increased phosphorylation of CRMP-2 was observed in PC12 cells by PI3K inhibitors, and decreased phosphorylation of CRMP-2 were observed in PC12 cells by GSK-3β inhibitor. On the other hand, in late stage of ischemia, the effect of PI3K/GSK3β pathway involvement could not be observed, therefore it was concluded that PI3K/GSK-3β pathway plays a role in phosphorylation of CRMP-2 in early ischemic condition but not in late ischemic condition. The formation of CRMP-2 cleavage seems not to be regulated by CRMP-2 phosphorylation through PI3K/GSK-3β pathway. The functional role of 58 kDa CRMP-2 remains to be determined that might provide new therapeutic strategies to ischemic stroke.