Modulation of P-glycoprotein Function by Synthesized Xanthone Analogues

Abstract

Multidrug resistance (MDR), a major obstacle in clinical chemotherapy, is related to the over-expression of a plasma membrane glycoprotein, P-glycoprotein(P-gp). P-gp is an energy-dependent transmembrane drug efflux pump. It has been reported that P-gp decreases the intra-tumoral maintenance of cytotoxic compounds below the therapeutic thresholds in MDR cancer cells, resulting in the limited tumor killing. Therefore, the use of P-gp inhibitors that reverse the MDR phenotype-associated P-gp-mediated efflux can be a strong attempt to improve the efficacy of chemotherapeutic agents. Many studies have shown that some xanthone derivatives have not only anti-inflammatory activities, antibacterial activities, and antihistamine activities but also anticancer activities. However, there has been no report for xanthone derivatives being used as a chemotherapeutic agent for the treatment of cancer. The objective of this study was to investigate the effect of synthesized xanthone analogues on P-glycoprotein function in human breast cancer cell line, MCF-7/ADR. The cytotoxicity of DNM was measured using a modified SRB staining assay. Accumulation of 0.05mM [³H]-daunomycin (DNM), a P-gp substrate, was examined for 2 hours in the presence and absence of the synthesized xanthone analogues for 2 hours. The amount of DNM effluxed for one hour was calculated by subtracting the amount of DNM remaining in the cells for one hour after treatment with the xanthone analogues from the total pre-accumulated amount of DNM. Verapamil, a well known P-gp inhibitor, was used as the positive control. As a result, six compounds (SW-3, SW-4, SW-18, SW-25, SW-35, and SW-37) significantly decreased the IC_(50) of DNM without showing cytotoxicity at a concentration of 100 μM, and they were used to examine the effects of these compounds on accumulation and efflux of DNM. In particular, SW-4 notably increased DNM cytotoxicity similar to that seen with the P-gp inhibitor verapamil, suggesting the possibility of the potent P-gp inhibitory activity of this compound. SW-35 remarkably enhanced the level of [³H]-DNM accumulation more than 7 fold, and decreased the [³H]-DNM efflux as much as verapamil, showing even stronger inhibitory effect on P-gp than the known P-gp inhibitor, verapamil. In addition, three compounds (SW-4, SW-18, and SW-25) moderately increased DNM accumulation and decreased DNM efflux, suggesting that these compounds may inhibit P-gp-mediated efflux transport. In conclusion, SW-35 was found to have the most potent P-gp inhibitory effect, and this was even stronger than the representative P-gp inhibitor, verapamil. SW-4, SW-18, and SW-25 were also found to be moderately effective at inhibiting P-gp function. This chemo-sensitizing effect of the compounds might be useful for chemotherapy strategy, resulting in the reversal of P-gp-mediated MDR. To the best of our knowledge, this is the first report on P-gp inhibitory activity of xanthone analogues.;항암치료의 주요 장애물인 약물의 다약제 내성 (multidrug resistance, MDR)은 P-당단백질의 과다발현과 관련된다. P-당단백질은 에너지 의존 약물 배출 펌프로서, 암세포 내 항암제의 농도를 치료상 역치 이하로 떨어뜨려서 암세포의 완전한 사멸을 방해한다. 그러므로 P-당단백질 매개 약물배출과 관련된 다약제 내성을 역전시키는 P-당단백질 저해제의 사용은 화학요법제의 효능을 향상시키는 유용한 방법이 될 수 있다. 잔톤 유도체들이 항염증, 항균, 항히스타민 작용 뿐 아니라 항암 작용을 나타낸다는 사실은 여러 연구들을 통해 보고되었다. 그러나 잔톤 유도체가 암 치료를 위한 화학요법제 또는 항암증감제(chemosensitizer)로서 쓰인 예는 아직까지 보고된 바가 없다. 따라서, 본 연구에서는 P-당단백질이 과다 발현된 인체 유방암 세포에서, 새로 합성된 잔톤 유도체들이 P-당단백질 활성에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다. P-당단백질의 기질인 도노마이신의 세포독성은 sulforhodamine B (SRB) 염색법을 사용하여 측정하였다. [³H]로 표지된 0.05mM의 도노마이신이 2시간동안 합성 잔톤 유도체들의 존재 하에서 얼마나 세포 내로 축적되는지를 조사하였고, 1시간 동안 세포 밖으로 배출된 양을 알아보았다. 이 때, 세포 밖으로 배출된 도노마이신의 양은 1시간 동안 세포를 도노마이신으로 전처리하여 축적된 총 양에서 잔톤 유도체들을 처리한 지 1시간 후에 세포 내에 남아있는 양을 빼서 계산하였다. 양성 대조군으로는 P-당단백질 저해제로 잘 알려져 있는 베라파밀을 사용하였다. 그 결과, 합성 잔톤 유도체들 가운데 여섯 화합물(SW-3, SW-4, SW-18, SW-25, SW-35, and SW-37)이 사용된 농도 (100μM)에서 세포독성 없이 도노마이신의 IC_(50)값을 유의성 있게 감소시켰다. 이들 중 특히 SW-4는 도노마이신의 세포독성을 베라파밀만큼 크게 증가시켰는데, 이는 이 물질이 강력한 P-당단백질의 저해제가 될 수 있음을 시사하였다. 또한 이 화합물들이 P-당단백질의 활성에 영향을 미치는지를 더 확인하기 위하여 도노마이신의 세포 내 축적 및 세포 외 배출에 미치는 영향도 조사하였다. 그 중 SW-35는 도노마이신의 축적을 대조군에 비해 7배 이상 유의성 있게 증가시켰고, 도노마이신의 배출은 베라파밀과 유사한 정도로 감소시켰다. 그 외의 세가지 화합물들 (SW-4, SW-18, SW-25)도 유의성 있게 도노마이신의 축적을 증가시켰고, 배출을 감소시켰다. 결론적으로, SW-35가 베라파밀보다 더 강력한 P-당단백질 억제 효과를 나타내었으며, SW-4, SW-18, SW-25도 P-당단백질의 활성을 억제하는데 어느 정도는 효과적이었다. 잔톤 유도체들의 이런 항암증감(chemosensitizing) 효과는 P-당단백질 관련 다약제 내성을 역전시킴으로써 화학요법제들의 항암효과를 증가시키는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 연구는 잔톤 유도체들의 P-당단백질 억제 효과에 대해 처음으로 조사한 것으로 그 의의가 크다 할 수 있겠다.