다이옥신이 미토콘드리아 손상에 미치는 영향 및 소핵시험법을 이용한 유전독성 평가

Abstract

환경 내 독성 물질 가운데 2,3,7,8-TCDD를 비롯한 dioxin-like compound들은 발암성, 최기형성 물질로 알려져 있다. 그 중 TCDD는 가장 독성이 강한 물질로 사람은 물론 생태계에 해로운 영향을 미치며 발암 촉진, 간 독성, 발육 억제, 면역 억제 등과 같은 병리학적 작용을 갖는다. 또한 2,3,7,8-TCDD는 superoxide, peroxide radicals를 생성하여 산화적 스트레스를 일으키며 이로 인해 DNA 단일 가닥을 절단하고 미토콘드리아의 기능 장애를 유발한다. 2,3,7,8-TCDD가 미토콘드리아 기능 장애에 미치는 영향을 직접적으로 알아보기 위해 JC-1 dye를 이용하여 미토콘드리아 내막의 전위차 변화(△ψ)를 측정하였다. 그 결과, TCDD를 세포에 처치하면 10분 후 미토콘드리아 내막의 전위차가 감소하여 탈분극이 일어났지만 바로 음성 대조군 수준으로 회복되었다. 이 때 미토콘드리아 손상은 활성 산소(ROS)나 extracellular Ca^(2+)의 세포 내 유입에 의한 것은 아님을 알 수 있었다. TCDD를 2시간 정도 단시간 처치했을 때에는 활성 산소가 증가하지 않았으나 0.25 nM TCDD는 처치 48 시간 후, 0.5 nM TCDD는 처치 12 시간 후에 활성 산소 발생이 증가하였다. 그러나 그에 반하여 동일 조건 하에서 미토콘드리아 내막의 전위차 변화는 일어나지 않았으며 단백질의 카르보닐기가 유의적으로 증가하지 않았다. 따라서 TCDD에 의해 활성 산소가 증가하였으나 단백질 산화 및 미토콘드리아 손상은 관찰되지 않았다. TCDD가 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하기 위하여 DAPI assay 및 fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis, MTT assay 분석을 한 결과 TCDD (0.25 nM, 0.5 nM)에 의한 세포 사멸 또는 세포 독성은 일어나지 않았다. 따라서 TCDD가 미토콘드리아 손상을 일으키는데 잠재적인 다른 요인들이 작용할 것으로 사료된다.;This study sought to validate genotoxicity and predict carcinogenecity by micronucleus assay. A total of 22 substances in 4 groups were taken for the test to validate the propriety of genotoxicity. Among them are eight kinds of genotoxic carcinogen (melphalan, diethylstilbestrol, urethane, chlorambucil, dibenz(a,h)anthracene, methyl methanesulfonate, N-nitroso-N-methylurea, N-nitrosodimethylamine), eight kinds of nongenotoxic carcinogen (1,4-dioxane, tetrachloroethylene, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, chloro-prene, nitrobenzene, nitromethane, 1,4-dichlorobenzene, ethyl benzene), three kinds of genotoxic noncarcinogen (acetonitrile, diallyl phthalate, L-ascor-bic acid), and three kinds of non-genotoxic noncarcinogen (caprolactam, bis-phenol A, chlorpheniramine maleate). Positive control was included in order to improve reliability of the test and the same test was conducted three times to evaluate reproducibility. Micronucleus frequency was decided to be positive based on OECD guideline. In the case of melphalan, L-ascorbic acid, chlorambucil, dibenz(a,h)anthrace-ne, methyl methanesulfonate, N-nitroso-N-methylurea and N-nitrosodime-thylamine, micronucleis were increased concentration-dependently with or without S9, compared with a negative control. Diethylstilbesterol, urethane, 1,4-dioxane, tetrachloroethylene, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, chloropr-ene, nitrobenzene, nitromethane, 1,4-dichlorobenzene, ethyl benzene, acetoni-trile, diallyl phthalate, L-ascorbic acid, caprolactam, bisphenol A, chlorpheniramine maleate did not show a significant increase with or without S9, compared with negative control. The above-mentioned results decided that melphalan, L-ascorbic acid, chlorambucil, dibenz(a,h)anthracene, methyl methanesulfonate, N-nitroso-N-methylurea and N-nitrosodimethylamine have positive result and 8-hydroxyquinoline, emodin, methyl carbamate, o-nitrotoluene, D-mannitol, 1,2-dichlorobenzene have negative result. The sensitivity of the in vitro micronucleus assay for carcinogens was 37.5% and the precision of the in vitro micronucleus assay for noncarcinogens was 83.3%.