IN-1233, ALK5 저해제에 의한 유방암의 폐 전이 억제 작용 연구

Abstract

Breast cancer is the major cancer in female around the world. In America, the rate of death in female caused by breast cancer was ranked second (based on 2005 data), and also in Korea it is the most common cancer in female (based on 2002 data). Breast cancer frequently metastasizes to distal organs, especially lung and bones. These days research on cancer metastasis and developing an anti-cancer agents, targeting metastasis inhibition, are increasing. Acquiring motility and EMT, which are a process of epithelial cells lose their properties and turn into a mesenchymal cells, are an important mediators in the progression of cancer cells. Through this process, cancer cells move into the vascular and develop into a metastatic cancer. When metastasis has happened to the distal organ, cancer cells make many factors that are related to angiogenesis and cell growth. TGF-β is one of the important cytokine that regulate the progression of cancer through EMT, degradation of the extracellular matrix, metastasis, angiogenesis and repression of immune system. Consequently, the development of the anti-cancer agents targeting TGF-β signaling has already prompted much research. In these study, we studied a mechanism of IN-1233 which is developed as a TGF-β type 1 receptor (TβRI/ALK5) kinase inhibitor and its anti-tumorigenic effect in metastatic breast cancer models, MMTV/c-Neu transgenic mouse in vivo and MDA-MB-231 breast cancer cell in vitro. In MDA-MB-231 breast cancer cell, IN-1233 effectively inhibited Smad2/3 phosphorylation induced by TGF-β. Also IN-1233 inhibited a cell growth induced by TGF-β and the expression of the TGF-β target genes such as p21WAF1, PAI-1 and fibronectin. Through these results, we could know that IN-1233 effectively supressed TGF-β signaling via Smad pathway. IN-1233 attenuated TGF-β-induced cell motility in a wound healing assay and significantly inhibited the expression of ANGPTL4 which is a key mediator of lung metastasis. And it down regulated the marker of breast epithelial cell, beta-casein, in dose-dependent manner in mammary cancer of MMTV/c-Neu mice. In lung tissue, beta-casein level was significantly inhibited by only in a high dose of IN-1233 treatment. Anti-metastatic effect of IN-1233 is associated with many factors which are related to EMT, degradation of extracellular matrix and breast cancer metastasis. Key markers of EMT such as N-cadherin, fibronectin and EMT related transcriptional factors, Snail, SIP1 and Twist, were over-expressed by TGF-β and attenuated by IN-1233. And proteolytic enzymes like MMP-2, MMP-9 were effectively repressed by IN-1233 in both in vivo and in vitro. IN-1233 also inhibited the expression of CTGF, CXCR4 and PTHrP which are important mediators in metastasis and angiogenesis, in vitro. In MMTV/c-Neu mouse model, we examined the relationship between IN-1233 and factors related to bone and lung metastasis. Expression of BSP in mammary cancer and lung tissue were inhibited a little by IN-1233. And IN-1233 effectively repressed the expression of CXCR4 in a dose-dependent manner and its inhibitory action was more significant in lung. We also examined the expression of Ski, which is a key repressor of TGF-β signaling via interaction with Smad2, Smad3, and Smad4, to determine whether IN-1233 actually increases Ski expression level. In MDA-MB-231 breast cancer cell, TGF-β effectively degraded Ski and IN-1233 significantly recovered the expression of Ski. Also IN-1233 effectively increased the Ski gene expression by dose-dependent in both mammary cancer and lung in MMTV/c-Neu mice. Then we examined the Ski protein level by time-course, and the results showed that Ski protein was effectively degraded in both 2 hr and 24 hr after TGF-β treatment and IN-1233 significantly increased the Ski protein level in both time points. Taken together, we could confirm that IN-1233 actually work as a TGF-β type Ⅰreceptor kinase inhibitor and effectively regulate many factors which are related to EMT, extracellular matrix degradation and metastasis. In addition, we could find the possibility of interaction between IN-1233 and HDAC (histone deacetylase complex) due to our data suggesting that Ski could be regulated either directly or indirectly by IN-1233. Developing more effective anti-cancer drugs through combination-therapies between anti-metastasis agent, IN-1233, and growth inhibitory agent, HDAC inhibitor, is expected and further research might be needed.;유방암은 전세계적으로 여성에게서 주로 발생하며, 미국에서는 암으로 인한 사망률 2위(2005년도 기준), 한국에서도 발병률 1위(2002년도 기준)를 차지한다. 유방암은 특히 폐와 뼈로의 전이가 일어난다. 이러한 전이를 억제하는 기전을 연구하고 target으로 한 항암제의 개발이 최근 증가하는 추세이다. 암이 진행이 될 때는 암세포가 이동성을 가지고 상피세포의 성질에서 간엽세포의 성질로 바뀌는 Epithelial-Mesenchymal transition (EMT) 과정을 거쳐야 하며 세포막을 분해함으로 혈관으로의 이동을 촉진하고 전이성 암으로 발전하게 된다. 전이가 일어난 암세포는 그 곳에서 신생 혈관을 형성하며 다시 증식하여 속발성 종양을 형성하게 된다. 이러한 EMT, 세포 막 분해, 전이, 신생 혈관 형성 그리고 면역 억제와 같은 작용을 통해 암의 진행을 조절하는 중요한 cytokine 중 하나가 바로 TGF-β이다. 따라서 최근 TGF-β signaling을 target으로 한 항암제의 개발이 많이 이루어지고 있다. 따라서 이번 연구에서는 TGF-β typeⅠ 수용체(TβRⅠ/ALK5) kinase 억제제로 개발된 IN-1233의 기전과 항암 효과를 알아보고자 전이성 유방암 모델인 MMTV/c-Neu 유전자 도입 동물과 MDA-MB-231 유방암 세포를 이용해 실험하였다. MDA-MB-231 유방암 세포에서 IN-1233은 TGF-β에 의해 유도된 Smad2/3의 인산화를 현저히 억제하는 것으로 나타났다. 또한 TGF-β에 의한 암 세포의 증식 역시 저해하는 것을 확인할 수 있었으며, TGF-β 표적 유전자인 p21WAF1, PAI-1 그리고 fibronectin의 발현을 억제하는 것을 통해 IN-1233이 Smad2/3의 인산화를 저해함으로 TGF-β signaling을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. IN-1233은 TGF-β에 의해 증가한 세포의 이동성을 억제하였고, 폐로의 전이와 관련된 ANGPTL4의 발현을 유의적으로 저해하였다. 그리고 MMTV/c-Neu 동물 모델에서 유방 세포의 지표라고 할 수 있는 β-casein을 유방암 조직에서는 농도 의존적으로 억제하였고, 유방으로부터 전이된 폐 조직에서는 고농도인 40 mg/kg에서 유의적으로 억제하였다. IN-1233에 의한 유방암 전이 억제 작용은 EMT나 세포막 분해 그리고 유방암 전이 관련 유전자들과도 연관이 있다. EMT의 중요한 지표인 N-cadherin, fibronectin과 EMT 관련 전사 인자들인 Snail, SIP1 그리고 Twist는 TGF-β에 의해 발현이 증가하였으며, IN-1233에 의해서는 모두 억제되었다. 그리고 전이와 관련된 단백분해 효소인 MMP-2, MMP-9은 in vivo와 in vitro에서 모두 TGF-β에 의해 유도된 발현 정도를 IN-1233에 의해 효과적으로 저해하였다. 전이와 신생 혈관 형성에 관여하는 CTGF, CXCR4 그리고 PTHrP 역시 in vitro 상에서 TGF-β에 의해 발현이 증가하였고 IN-1233은 이를 억제하였다. MMTV/c-Neu 동물 모델에서 뼈와 폐로의 전이 관련 유전자들을 실험한 결과, BSP는 암 조직과 폐 조직 모두에서 농도와 큰 상관없이 IN-1233에 의해 발현이 조금 감소하였으며, CXCR4는 암 조직과 폐 조직 모두에서 농도 의존적으로 감소하였으나 유방암에서보다 폐에서 그 억제 효과가 더 유의적으로 나타났다. Smad2, Smad3 그리고 Smad4와 상호작용함으로 TGF-β signaling을 억제하는 Ski의 발현이 IN-1233에 의해 실제로 증가되는지 알아보기 위해 실험한 결과, MDA-MB-231 세포에서는 TGF-β에 의해 현저히 분해되었으며, IN-1233에 의해서는 유의적으로 증가하였다. 그리고 MMTV/c-Neu 동물 모델에서 역시 IN-1233에 의해 유방과 폐 조직 모두에서 농도 의존적으로 현저히 증가하였다. TGF-β에 의해 Ski 단백질이 분해되는 것을 시간 별로 확인한 결과, 2시간과 24시간 모두에서 현저히 TGF-β에 의해 분해되었으며 IN-1233을 처치한 경우에는 2시간과 24시간 모두에서 분해가 억제되고 단백질 양이 증가하였다. IN-1233이 실제로 TGF-β type Ⅰreceptor kinase를 억제하는 약물로서 효과적으로 TGF-β signaling을 억제하고, 이에 따라 TGF-β에 의한 암 세포의 이동성 증가, 세포 외 간질의 분해, EMT 그리고 전이와 관련된 여러 요인을 효과적으로 조절함을 이번 연구를 통해 알 수 있었다. 나아가 TGF-β를 조절하는 Ski를 직접적 또는 간접적으로 조절하는 결과를 통해 HDAC과의 연관성을 확인할 수 있었다. 전이와 관련된 여러 과정을 조절하는 TβRⅠ 억제제인 IN-1233과 암 세포의 증식을 억제하는 HDAC 억제제와 병용 요법을 통해 보다 효과적인 항암제의 개발이 예상되며 더 많은 연구가 필요할 것이다.