The Screening System for Novel Cardiomyocyte Differentiation Factors

Abstract

Stem cells are multipotent cells with the ability to self-renew and differentiate into specialized cells in response to appropriate signals. And the genetic programs controlling early cardiogenesis are poorly understood. The development of new approaches for the directed differentiation of embryonic stem (ES) cells into cardiomyocytes will likely provide therapeutic application of ES cells in heart disease. To establish the system for identification of novel factor using small molecules, generated mouse ES cell line expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) under direction of alpha-myosin heavy chain (alpha-MHC) gene promoter that specifically works in cardiomyocytes. After ES cells were cultured in hanging drop for three days, the resultant individual embryonic body (EB) was treated with 10μM ascorbic acid. Then green fluorescence protein positive areas were scored and fluorescence activated cell sorter (FACS) analysis was used for the verification of cardiomyocyte differentiation. And large-scale expression studies were performed using Illumina expression microarray. Cardiomyocytes derived from ES cells strongly express genes required for regulation of signal transduction, developmental process, cell metabolism; these genes are required for cardiomyocytes to fulfill their physiologic function. In addition, I compared gene expression profile between undifferentiated ES cells and differentiated cells through EBs with or without ascorbic acid treatment. Eventually, Adm and Rgs5 were selected to effective factors. Thus, these genes were confirmed that biological validation of microarray by immunostaining of mouse fetuses. A further direction of this study will be to identify novel molecules regulating fate of stem cell and to identify novel gene for important on cardiomyocyte differentiation.;배아줄기세포는 배발생 과정 중 배반포의 내세포괴에서 유래한 세포로서 미분화 상태로 무한증식이 가능하며 적절한 신호전달에 의해 삼배엽 유래의 특성화된 세포로 분화가 가능하다고 알려져 있다. 대부분 심근 세포의 기능 상실로 나타나는 심혈관 질환은 손상된 심장 세포들의 대체와 심장 기능을 완벽하게 복구하기 위해 줄기 세포를 이용한 심근세포로의 분화 연구가 필요하다. 따라서 본 실험에서는 배아줄기세포가 심근세포로 효율적으로 분화하는 조건을 세우고 새로운 기능을 하는 유전자를 발굴할 수 있는 시스템을 확립하고자 하였다. 심근세포로 분화될 때 alpha-myosin heavy chain (MHC) 유전자의 promoter에 의해 조절 받아 green fluorescence protein (GFP)을 발현하는 배아줄기세포를 이용하여 심근세포로의 분화를 유도하였다. Hanging drop culture 방법을 이용하여 3일에 걸쳐 embryonic body (EB) 를 형성 시킨 후 ascorbic acid를 10uM로 처리하여 GFP를 발현하는 부분의 면적을 점수화하고, FACS분석을 함으로써 ascorbic acid의 심근분화 촉진 효과를 확인하였다. 또한 Illumina expression microarray를 이용하여 심근세포로 분화될 때의 transcription profiling을 알아보았으며, 사용한 시료는 real-time RT-PCR로 검증하여 사용하였다. Microarray결과를 통해 배아줄기세포가 심근세포로 분화될 때 세포 대사와 발생단계, 여러 신호전달에 관여된 것을 확인하였고, 그들의 심근세포와 관련된 여러 유전자들의 발현도 확인할 수 있었다. 또한 심근분화에 효과적인 후보작용유전자인 Adm, Rgs5를 선별하여, 마우스 심장발생단계의 발현 여부를 면역염색으로 확인함으로써 배아줄기세포를 심근세포로 효율적으로 분화시키는 시스템을 확립하였다. 본 연구에서 확립한 시스템은 배아줄기세포의 심근세포로의 분화단계에 영향을 미치는 신호전달에 관한 연구와 새로운 분화인자의 발굴을 가능하게 하고, 저분자 화합물과 배아줄기세포를 이용한 세포치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다.