P2Y_(14) and PAR1 are positive regulators of RANKL-induced osteoclast differentiation

Abstract

Bone homeostasis is maintained by the balance between the activities of bone-forming osteoblasts and bone-resorbing osteoclasts. Osteoclasts (OCs) are multinucleated cells that play an important role in bone metabolism. The essential signaling molecules for osteoclast differentiation include macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kB ligand (RANKL). To gain insight into the mechanism of the RANKL-specific induction of the osteoclast differentiation program, I took gene chip approach to identify targets specifically induced via RANKL signaling pathway. Among identified targets, I show that RANKL selectively induces P2Y_(14) and PAR1, novel members of G-protein-coupled receptor, via MAP kinases pathway in bone marrow-derived monocyte/macrophage precursor cells (BMMs). Interestingly, both down regulation of P2Y_(14) by siRNA and suppression of PAR1 by PAR1 antagonist inhibited osteoclast differentiation. Activation of P2Y_(14) and PAR1 with specific agonists resulted in an increase of multinucleated osteoclast formation, respectively. In addition, Gi-coupled P2Y_(14) and PAR1 inhibit inhibition of adenylyl cyclase and protein kinase A prohibited RANKL-induced osteoclast differentiation and suppressed of P2Y_(14), PAR1, and NFATc1. Taken together, these results suggest that P2Y_(14) and PAR1 are positive regulators of RANKL-induced osteoclast differentiation.;파골세포 (osteoclast) 는 우리 몸에서 뼈를 분해함으로써 뼈의 재구성 (remodeling) 과 항상성 (homeostasis) 에 중요하게 작용하는 다핵세포 (multinucleated cell) 이다. RANKL (receptor activator of nuclear factor κB ligand) 에 의한 신호 전달은 M-CSF (macrophage colony stimulating factor) 와 함께 파골세포의 분화에 필수적이다. Gene chip을 이용하여 RANKL에 의해 유도되는 유전자를 선별하였다. 그 중에서 G protein-coupled receptor 인 P2Y14과 PAR1을 타깃으로 잡아 실험하였다. 그렇지만 파골세포 분화 과정에 있어서 P2Y_(14)과 PAR1의 역할은 밝혀진 바가 없다. siRNA를 이용하여 P2Y_(14)의 유전자를 적은 양으로 발현시켰을 때와 antagonist를 이용하여 PAR1의 유전자 발현을 억제시켰을 때, 파골세포의 분화가 억제되었다. 반대로 agonist를 이용하여 P2Y_(14)과 PAR1 각각의 유전자 발현을 활성화시켰을 때, 파골세포의 분화가 촉진되었다. 또한 MAPKs 억제제 (inhibitor)에 의해서 P2Y_(14)과 PAR1의 단백질 발현이 감소한 사실로 보아 RANKL에 의한 MAPK dependent pathway를 통해 P2Y_(14)과 PAR1이 발현된다는 것을 알게 되었다. RANKL에 의해 발현된 P2Y_(14)과 PAR1은 GPCR로 작용하는데, 그 때 adenylyl cyclase와 protein kinase A (PKA) 의 억제제를 처리하면 P2Y_(14), PAR1, 그리고 NFATc1의 단백질 발현이 감소하고, 파골세포의 분화도 억제되었다. 그러므로 이들 결과를 통해, P2Y_(14)과 PAR1은 파골세포의 분화에 있어서 중요한 양성 조절 인자로 작용한다는 결론을 내릴 수 있다.