Anticancer potential of daphnane-type diterpenes from Daphne genkwa

Abstract

Natural products have played major roles in drug discovery including development of anticancer agents. In this study, daphnane-type diterpenoids were isolated from the flower of Daphne genkwa (Thymelaeaceae) by a bioassay-guided fractionation with a potential anti-proliferative activity against human lung cancer cells, and the anti-proliferative activity and the mechanisms of actions were elucidated with yuanhuadine, one of the most potent isolates from the plant extracts, in cultured human non-small lung cancer A549 cells. In chapter I, two new daphnane-type diterpene esters 5β-hydroxyresiniferonol-6α,7α-epoxy-12β-propanoxy-9,13,14-ortho-2E,4E-decadienoate (yuanhuahine) (1) and 5β-hydroxyresiniferonol-6α,7α-epoxy-12β-butanoxy-9,13,14-ortho-2E,4E-decadienoate (yuanhualine) (2) were isolated from the flowers of Daphne genkwa (Thymelaeaceae) along with three known diterpene esters, yuanhuacine (3), yuanhuadine (4), and yuanhuagine (5) by a bioassay-directed fractionation employing the cytotoxicity assay the A549 human lung cancer cells. These compounds exhibited potent anti-proliferative effects against A549 cells with the IC50 values of 0.7-53 nM. Their structures were elucidated by spectral analysis, including 1D and 2D NMR experiments. In chapter II, yuanhuadine showed potent growth inhibition and relatively strong selectivity against lung cancer cells compared to a panel of several human cancer cell lines. Comparatively, yuanhuadine was nontoxic to human normal lung epithelial cells (MRC-5). In A549 cells, yuanhuadine exhibited the growth inhibition of the cells in a time- and dose-dependent manner with an IC50 value of 0.7 nM at 72 h incubation. Flow cytometric analysis revealed that yuanhuadine (20 nM) induced cell cycle arrest at G0/G1 as well as G2/M phase in A549 cells. The cell cycle arrests were well correlated with the expression of checkpoint proteins including the upregulation of cyclin-dependent kinase inhibitor p21, and down-regulation of cyclin A, cyclin E, cyclin B, cyclin dependent kinases 2 and 4, cdc2, phosphorylation of Rb and c-myc expression. There was also suppression in phosphorylation of phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1), Akt, glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β), and signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3). In addition, yuanhuadine inhibited the mammalian target of rapamycin (mTOR) which is downstream molecule of Akt and its downstream effector molecules, p70 S6 kinase (p70S6K) and eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1), indicating that the cancer cell growth inhibition by yuanhuadine might be in part mediated by the suppression of Akt/mTOR signaling pathway. Additionally, yuanhuadine inhibited epidermal growth factor (EGF)-induced epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathway by suppression of phosphorylation of EGFR (Y1068 and Y1173) and their downstream molecules such as Akt and extracellular regulated kinase (ERK) 1/2. Yuanhuadine also abrogated hepatocyte growth factor (HGF)-induced phosphorylation of c-Met and its downstream effectors including Akt, mTOR, Stat3, and focal adhesion kinase (FAK). Yuanhuadine was shown to influence the autophagy induction related to mTOR signaling. c-Cbl gene was overexpressed in lung cancer cells such as A549, SK-MES-1, NCI-H292, and NCI-H358 compared to the MRC-5 normal epithelial cells. Especially, NCI-H358 cells (resistant to yuanhuadine) expressed c-Cbl distinctively higher than other lung cancers. In addition to lung cancer cells, in colon and breast cancer cell line, HCT-116 and T47D cells (resistant to yuanhuadine) expressed higher c-Cbl gene than HCT-15 and MDA-MB-231 cells (sensitive to yuanhuadine). The expression of c-Cbl gene was decreased after treatment with yuanhuadine in a dose-dependent manner. In addition, the growth inhibitory effects of A549 xenografts in vivo were shown by oral administration of yuanhuadine. Synergistic effects were also observed when yuanhuadine was combined with gefitinib and cisplatin. Taken together, these findings suggest that yuanhuadine might provide a novel lead candidate for therapeutic agent against human lung cancer.;본 연구에서는, 사람 폐암세포주의 세포 성장 억제 효능에 대한 활성 추적분획법을 실시하여 원화 (the flowers of Daphne genkwa)로부터 5개의 daphnane-type diterpenoids를 분리하였으며 이 중 활성이 가장 뛰어난 yuanhuadine에 대하여 암세포의 성장 저해 효능 및 작용기전을 확인하였다. 원화로부터 3개의 알려진 daphnane-type diterpene esters인 yuanhuacine (3), yuanhuadine (4), yuanhuagine (5)과 함께 yuanhuadine의 구조 유사체인 새로운 2개의 화합물 5β-hydroxyresiniferonol-6α,7α-epoxy-12β-propanoxyl-9,13,14-ortho-2E,4E-decadienoate (yuanhuahine) (1)과 5β-hydroxyresiniferonol-6α,7α-epoxy-12β-butanoxyl-9,13,14-ortho-2E,4E-decadienoate (yuanhualine) (2)이 분리되었다. 이들 화합물은 A549 세포에 대하여 0.7-53 nM의 IC50 값을 가지며 높은 세포 성장 저해 활성을 나타내었으며 화합물들의 구조는 각종 이화학적 및 분광학적 기법을 사용하여 분석하였다. Yuanhuadine은 여러 암세포주들에 대하여 암세포 성장 저해 활성을 나타냈으며 이들 중 폐암세포주들에 대하여 선택적으로 더 높은 암세포 성장 저해 활성을 보이는 것으로 확인되었다. 이와 함께 yuanhuadine은 사람 폐 정상세포주인 MRC-5 세포에 대하여 독성을 거의 나타내지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 사람 폐암세포주인 A549 세포에 대한 yuanhuadine의 암세포 성장 저해 활성과 이에 대한 작용기전을 살펴보았다. A549 세포에 대하여 yuanhuadine은 시간 및 농도 의존적으로 세포 성장을 저해하였으며 72 시간 처리시 0.7 nM의 IC50 값을 나타내었다. 또한 yuanhuadine은 cytostatic하며 비가역적인 세포 성장 억제 효능을 나타내는 것으로 확인되었다. FACS 분석법에 의하여 yuanhuadine의 처리에 따른 세포의 주기형태 변화를 관찰한 결과, yuanhuadine은 A549 세포의 G0/G1기 및 G2/M기의 진행 억제를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 cyclin dependent kinase (cdk) inhibitor 인 p21 단백질 발현의 증가와 cyclin A, cyclin E, cyclin B, cdc2, cdk2, cdk4, p-Rb 및 c-myc 단백질 발현의 감소와 관련이 있는 것으로 확인되었다. 다음으로 암세포내의 주요 세포신호전달체계인 Akt/mTOR signaling pathway에 대한 yuanhuadine의 영향을 살펴본 결과, yuanhuadine은 Akt의 upstream에 해당되는 phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK-1)의 활성화를 억제하였으며 Akt의 활성을 강력하게 저해하고 Akt 아래 신호전달체계에 속한 glycogen synthase kinase-3β (GSK3β), signal transducers and activators of transcription 3 (Stat3) 및 mammalian target of rapamycin (mTOR)의 활성화를 억제하였다. 그리고 mTOR의 2가지 주된 downstream인 p70 S6 kinase (p70S6K)와 eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1 (4EBP1)의 활성화 또한 억제하였다. 이러한 결과를 바탕으로 yuanhuadine은 Akt/mTOR signaling pathway를 강력히 억제하는 것으로 생각된다. 이 Akt/mTOR는 여러 receptor tyrosine kinase (RTK) 들에 의하여 영향을 받는데 본 연구에서는 폐암에서 주된 표적으로 여겨지는 epidermal growth factor receptor (EGFR) 및 c-Met과 각각의 downstream signaling pathway에 대한 yuanhuadine의 영향을 알아보았다. 먼저 EGFR에 대하여 yuanhuadine은 epidermal growth factor (EGF)에 의하여 유도된 EGFR 및 이의 downstream effector인 Akt와 extracellular regulated kinase (ERK) 1/2의 활성화를 억제하는 것으로 나타났다. 그리고 yuanhuadine은 hepatocyte growth factor (HGF)에 의하여 유도된 c-Met의 활성화를 저해할 뿐 아니라 c-Met의 단백질 발현 자체를 감소시키는 것으로 확인되었으며 c-Met의 downstream signal에 속하는 Akt, forkhead box protein FOXO3a (FKHRL1), focal adhesion kinase (FAK), STAT3, mTOR, p70S6K, and 4EBP1의 활성화 또한 저해하는 것으로 나타났다. 이외에 최근 새로운 폐암의 지표로 제시된 c-Cbl의 발현에 대하여 확인해 본 결과 여러 폐암세포주 중 yuanhuadine에 대한 암세포 성장 저해 활성이 낮게 나타난 NCI-H358 세포에서 c-Cbl의 발현이 높은 것으로 나타났으며 이러한 경향은 대장암세포주 및 유방암 세포에서도 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 c-Cbl의 발현이 높은 NCI-H358세포를 siRNA 기법을 사용하여 c-Cbl의 발현을 감소시킨 뒤 yuanhuadine에 의한 암세포 성장 저해 활성을 확인해 본 결과 유의적으로 c-Cbl 발현이 감소된 세포에서 더 높은 암세포 성장 저해 활성이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 이 외에 A549 및 HCT-15 세포에서 c-Cbl의 발현은 yuanhuadine에 의하여 농도 의존적으로 감소되었다. 또 다른 작용기전인 Akt/mTOR signaling과 관련이 있는 것으로 보고되고 있는 autophagy에 대한 yuanhuadine의 영향을 살펴본 결과 acridine orange 및 monodansylcadaverine (MDC) 염색법에 의하여 yuanhuadine이 autophagy를 유도함을 간접적으로 확인할 수 있었다. 이 외 in vivo에서 yuanhuadine의 경구투여에 따라 A549 xenograft의 성장 저해가 유도되었다. 그리고 A549 세포에 대하여 현재 폐암제로 사용되고 있는 gefitinib 및 cisplatin과 yuanhuadine의 combination 처리 결과 yuanhuadine은 이들 약물에 대하여 높은 synergy 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 지금까지의 결과를 종합해 볼 때, yuanhuadine은 폐암에 대하여 선택적인 항암효능을 갖는 천연물 유래 항암제 개발을 위한 선도물질로서 가능성이 제시된다.