원화의 암세포 성장 저해 활성 물질 규명 및 작용기전 연구

Abstract

암을 정복하려는 인류의 노력에도 불구하고 암으로 인한 사망률은 지속적으로 증가하고 있을 뿐만 아니라 암의 종류 또한 다양해지고 있는 추세이다. 특히 폐암은 환경오염물질의 증가와 흡연으로 인해 발생율이 꾸준히 증가하고 있으나 상대적으로 치료가 어렵기 때문에 사망률은 개선되지 않고 있다. 이에 이미 발생한 암을 치료하기 보다는 독성이 없는 안전한 화학물질을 이용하여 발암과정을 인위적으로 억제하거나 지연 또는 역전시킴으로써 정상세포가 암세포로 전이되는 것을 예방하는 개념의 방법이 부각되고 있으며 천연물을 이용한 화학적 암예방의 중요성이 증가하고 있다. 천연물을 대상으로 유용한 화학적 암예방제를 탐색하려는 연구가 활발히 진행 중에 있으나 대부분의 연구결과는 용매 추출이거나 부분 정제 분획물에 대한 효능검증에 그치는 경우가 많다. 따라서 정제된 구조가 정확히 밝혀진 특정 성분에 대한 효능검증 시험은 그 가치가 높다 하겠다. 이에 본 연구에서는 암세포저해활성검색에서 폐암세포에 대한 선택적인 성장저해 효과를 나타내었던 원화(Daphne genkwa)를 선정하여 유효성분을 분리 정제하고 구조를 분석하여 효능기전을 밝힘으로써 화학적 암예방제 개발에 가능성을 제시하고자 하였다. 원화를 메탄올 추출 후 추출물에 대해 용매 분획화를 실시하였으며 그 결과 n-hexane(IC50; 0.18 mg/ml)과 methylene chloride(IC50; 0.24 mg/ml)분획에서 뛰어난 폐암세포저해활성을 확인 할 수 있었으며 이중 methylene chloride 분획으로부터 bioassay-guided fraction 법을 이용하여 open column chromatography와 preparative HPLC 및 preparative TLC를 통하여 유효활성물질 compound 1을 분리하였고, NMR 등 기기 분석을 통하여 compound 1이 yuanhuacine 임을 확인할 수 있었다. yuanhuacine 은 사람 폐암세포주 A549(IC50 ; 3 ng/ml)에 대하여 높은 선택적 저해활성을 나타내었으며, 사람 결장암 세포주 Col2(IC50 > 20 mg/ml)와 HT29(IC50 > 20 mg/ml), 위암 세포주 SNU-638(IC50 > 20 mg/ml), 혈액암 세포주 HL-60(IC50 > 20 mg/ml)에 대해서는 저해활성 효과를 나타내지 않았다. 또한 사람 정상 폐세포주인 MRC-9(IC50 > 20 mg/ml)에서도 역시 저해활성효과를 나타내지 않았다. 암세포 성장 저해 작용기전으로 yuanhuacine이 폐암세포에서 G1 cell cycle arrest를 유발시키는 것을 확인할 수 있었는데 이러한 작용기전은 활성화된 pAkt의 발현을 억제함으로 써 GSK3b의 활성을 유도하는 것 임을 확인할 수 있었다. pAkt의 활성억제에 의해 활성화된 GSK3b는 궁극적으로 cyclin D1과 c-myc의 G1 phase 진행인자들의 발현을 억제시켰다. 또한 G1 phase의 중요 세포주기조절 단백질인 pRb의 발현도 강하게 억제되는 것을 확인하였다. 동시에 cdk inhibiter인 p21은 강하게 유도되어 세포주기의 진행을 억제시켰다. 한편, yuanhuacine은 ERK의 활성화를 억제함으로써 세포성장억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 yuanhuacine의 암세포저해활성은 pAkt의 활성을 저해함으로써 GSK3b의 활성을 유도하여 G1기의 세포주기 진행 인자인 cyclin D1, c-myc의 발현 억제 및 cdk inhibitor 인 p21의 발현을 유도하는 기전으로 G1 cell cycle arrest에 의한 것 임을 확인할 수 있었다. 또한 세포성장조절자인 ERK의 활성을 억제하여 세포의 성장이 억제된 것 임을 알 수 있었다. 이상으로 원화에서 분리된 폐암세포에 선택적 저해활성을 가진 yuanhuacine은 암세포 성장 저해 물질로서의 가능성이 제시된다 하겠다. ;Lung cancer is the leading cause of cancer death in the world. In order to discover novel potent anti-cancer agents against human lung cancer, methanolic extracts of approsimately 175 herbal medicines were evaluated for cytotoxic activity with sulforhodamine B(SRB) assay. As a result, the extract of Daphne genkwa was found to be selective cytotoxic activity in human lung cancer cells(A549). The cytotoxic principles of the extract were monitored by bioassay-guided fractionation with the methylene chloride partition by silicagel column chromatography. One compound was isolated as an active principle and characterized by instrumental analysis: yuanhuacine, daphnan orthoester, showed a strong selective cytotoxic activity (A549 IC50; 3 ng/ml, Col2 IC50>20 mg/ml). In terms of action mechanism, yuanhuacine exhibited a relatively selective growth inhibition against human lung cancer cells compared to normal lung cells. Flow cytometric analysis revealed that yuanhuacine induced arrest at the G1 phase cell cycle. Yuanhuacine treatment elevated the expression levels of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21, and down-regulated the expression of G1-association proteins, cyclin D1, c-myc and Rb phosphorylation. In addition, the expression of pAkt and pERK was decreased and followed by the reduction of inactivation of GSK3b by treatment of yuanhuacine, indicating that yuanhuacine induced G1 cell cycle arrest mediated by the suppression of pAkt. These data suggest that the potential of yuanhuacine to serve as a selective anti-tumor agent against human lung cancer cells by virtue of arresting the cell cycle and modulation of signal transduction in a Akt-medicated pathway.