Extracellular K+-induced modulation of Ca2+ signaling in endothelial cells

Abstract

The effects of extracellular K^+ on endothelium-dependent relaxation (EDR) and on intracellular Ca^2+ concentration ([Ca^2+]_i) were examined in mouse aorta, mouse aorta endothelial cells (MAEC) and human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). In mouse aortic rings precontracted with prostaglandin F_2α or norepinephrine, an increase in extracellular K^+ concentration ([K^+]_o) from 6 to 12 mM inhibited EDR in a concentration- dependent manner. In endothelial cells, an increase in [K^+]_o inhibited the agonist-induced [Ca^2+]_i increase in a concentration-dependent manner. Similar to K^+, Cs^+ also inhibited EDR and the increase in [Ca^2+]_i in a concentration-dependent manner. In current-clamped HUVEC, increasing [K^+]_o from 6 to 12 mM depolarized membrane potential from -32.8 ± 2.7 to -8.6 ± 4.9 mV (n=8). In voltage-clamped HUVEC, depolarizing the holding potential from -50 to -25 mV decreased [Ca^2+]_i significantly from 0.95 ± 0.03 μM to 0.88 ± 0.03 μM (n=11; P<0.01), and further decreased [Ca^2+]_i to 0.47 ± 0.04 μM by depolarizing the holding potential from -25 to 0 mV (n=11; P<0.001). Ca^2+ -activated K^+ channel blockers, tetraethylammonium, charybdotoxin, clotrimazole, and econazole inhibited EDR and agonist-induced [Ca^2+]_i increase in voltage-clamped MAEC. The intermediate conductance Ca^2+ -activated K^+ channel openers, 1-ethyl-2-benzimidazolinone, chlorzoxazone, and zoxazolamine reversed the K^+ -induced inhibition of EDR and increase in [Ca^2+]_i. In addition, the K^+ -induced inhibition of EDR and increase in [Ca^2+]_i was abolished by the Na^+ -K^+ pump inhibitor, ouabain (10 μM) and the Na^+ -Ca^2+ exchanger (NCX) inhibitor, KB-R7943 (30 μM) or Ni^2+ (300 μM). Ni^2+ and KB-R7943 hyperpolarized the depolarized-membrane potential by the increase of [K^+]_o. These results indicate that an increase of [K^+]_o in the physiological range (6 - 12 mM) inhibits [Ca^2+]_i increase in endothelial cells and diminishes EDR by depolarizing the membrane potential, decreasing K^+ efflux and activating the Na^+ -K^+ pump via activating the forward mode of NCX, thereby modulating the release of endothelium-derived vasoactive factors from endothelial cells and vasomotor tone. Key words: endothelial cell, intracellular calcium, extracellular K^+, endothelium-dependent relaxation;본 연구는 세포외 K^+이 쥐 대동맥의 내피세포 의존성 이완과 쥐 대동맥 및 인간제대정맥 내피세포의 세포내 Ca^2+에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 쥐 대동맥을 prostaglandin F_2α 혹은 norepinephrine으로 전처치하여 수축을 일으킨 후 세포외 K^+ 농도를 정상 6 mM에서 12 mM로 증가시키면 내피세포 의존성 이완을 농도 의존적으로 억제시켰다. 혈관내피세포에서는 세포외 K^+ 농도를 6 mM에서 12 mM로 증가시키면 효현제(agonist)에 의해 증가된 세포내 Ca^2+을 농도 의존적으로 감소시켰다. K^+과 마찬가지로, Cs^+도 역시 농도 의존적으로 내피세포 의존성 이완과 효현제에 의해 증가된 세포내 Ca^2+을 감소시켰다. 전류를 고정시킨 실험에서는 세포외 K^+ 농도를 6 mM에서 12 mM로 증가시키면 막전압이 -32.8 ± 2.7 mV에서 -8.6 ± 4.9 mV (n=8)로 저분극 되었다. 전압을 고정시킨 실험에서, 막전압을 -50 mV에서 -25 mV으로 저분극 시키면 효현제에 의해 증가된 세포내 Ca^2+을 0.95 ± 0.03 μM에서 0.88 ± 0.03 μM (n=11; P<0.01)으로 감소시켰으며 막전압을 -25 mV에서 0 mV으로 저분극 시키면 효현제에 의해 증가된 세포내 Ca^2+을 0.47 ± 0.04 μM (n=11; P<0.001)로 더욱 감소시켰다. 전압을 고정시킨 혈관내피세포에서 Ca^2+ -activated K^+ channel 억제제인 TEA, charybdotoxin, clotrimazole, econazole은 내피세포 의존성 이완과 효현제에 의한 세포내 Ca^2+의 증가를 감소시켰다. The intermediate conductance Ca^2+ -activated K^+ channel 효현제인, 1-ethyl-2-benzimidazolinone, chlorozoxazone, zoxazolamine는 내피세포 의존성 이완과 효현제에 의한 세포내 Ca^2+증가에 대한 K^+ -induced inhibition을 감소시켰다. 더하여, 내피세포 의존성 이완과 ATP에 의한 세포내 Ca^2+증가에 대한 K^+ -induced inhibition은 Na^+ -K^+ pump 억제제인 ouabain (10 μM)과 Na^+ -Ca^2+ 교환 (NCX) 억제제인 KB-R7943 (30 μM) 혹은 Ni^2+ (300 μM)에 의해 감소되었다. 세포외 K^+의 증가에 의한 막전압의 저분극이 Ni^2+와 KB-R7943에 의해 막전압이 과분극 되었다. 이상의 결과는 K^+ 농도가 생리학적 범위인 6 mM에서 12 mM 사이에서 증가할 때 막전압의 저분극, K^+ 유출의 감소 그리고 Na^+ -Ca^2+ 교환 기전 중 전방 방식(forward mode)에 의해 활성화된 Na^+ -K^+ pump를 통해 혈관내피세포의 혈관활성인자의 분비와 혈관운동성을 조절함으로써 효현제에 의한 세포내 Ca^2+ 증가를 막고 내피세포 의존성 이완을 억제시킨다는 것을 의미한다. 주요어: 혈관 내피세포, 세포내 calcium, 세포외 K^+, 내피세포 의존성 이완