한국여성의 질에서 분리된 유산간균총의 미생물학적, 분자유전학적 분석 및 우량간균 KLB46을 이용한 질염 치료의 예비적 임상실험 결과

Abstract

여성 질 내에 존재하는 유산간균(lactobacillus)은 포도당을 발효시켜 젖산을 생성하여 질 내 산성도를 유지하며, bacteriocin과 같은 항균 물질을 생성하여 병원체로부터의 감염을 방지하여 건강한 질 상태를 유지하는 역할을 한다. 세균성 질증(bacterial vaginosis)은 가임여성에서 생기는 가장 흔한 질염 중의 하나이며, 부인과적 수술 후 감염 및 임신 중 조기분만의 원인이 될 수 있다. 이러한 세균성 질증의 대부분은 항생제의 사용으로 높은 치료율을 보이나, 자주 재발되는 문제점을 지니고 있다. 이는 질 내 생태계(vaginal ecosystem)의 우점균총인 유산간균의 감소가 중요한 원인으로 알려져 있다. 따라서 유산간균을 probiotic로 세균성 질증의 치료에 이용하는 연구는 임상적으로 매우 의미 있을 것으로 판단된다. 이에 본 연구자는 한국 여성의 질에서 유산간균총(Lactobacillus species)을 분리하여 이들의 미생물학적, 분자유전학적 특성 및 항생제 감수성을 분석하고, 그 중 probiotics로서 사용될 수 있는 가장 유력한 유산간균주(Lactobacillus strain)를 선정하여 질염의 치료효과를 확인하고자 예비적 임상실험을 시행하였다. 이화여자대학교 목동병원 산부인과에 방문한 205명의 질염이 없는 건강한 성인 여자로부터 질 분비물을 채취하여 유산간균총을 동정, 분리하였다. 분리된 균주들은 catalase test, 세포 표면 소수성 검사, 항균 활성도 측정, 제한효소 절편 길이 다형성(Restriction fragment length polymorphism)을 이용한 분자 유전학적 분석 등을 시행하여 그 종류와 분포를 알아보고, 분리된 유산간균의 항생제에 대한 감수성을 분석하였다. 또한 probiotics로서의 가능성을 확인하기 위하여, 분리된 균주 중 가장 우수한 항균활성을 보인 Lactobacillus crispatus KLB 46 균주를 이용하여 세균성 질증 및 위축성 질염 환자를 대상으로 예비적 임상실험을 시행하여 아래와 같은 결과를 얻었다. 1. 분리된 유산간균주는 모두 105종으로 막대모양을 가지고, 그람 염색 결과 양성이며, catalase test 결과 음성을 보였다. 2. 분리된 유산간균주들은 61%에서 높은 세포표면 소수성을 보여 대체적으로 세포표면 소수성은 우수하였다. 3. 분리된 대부분의 유산간균주들이 항균활성을 보였고, 그 중 KLB 46이 가장 우수하였다. 3. 16S rDNA gene을 이용한 PCR-RFLP 방법을 이용하여 유산간균총의 분자 유전학적 특성을 분석한 결과, 가장 많이 분포하는 우점균주는 Lactobacillus crispatus와 Lactobacillus acidophilus 였고(51%), 우량균주 KLB 46은 Lactobacillus crispatus 였다. 4. 분리된 균주들을 대상으로 시행한 항생제 감수성 검사결과 metronidazole, gentamicin, kanamycin, streptomycin, ofloxacin에는 내성이 있었고, penicillin, erythromycin에는 감수성이 있었다. 5. 가장 우수한 항균 활성을 보인 우량균주 Lactobacillus crispatus KLB 46이 생산하는 항균 물질은 bacteriocin으로 추정되었다. 6. 생균을 4℃ 에 보존시 phosphate buffer와 자당을 첨가하였을 때 균의 생존력이 가장 우수하였다. 7. 우량균주 Lactobacillus crispatus KLB 46을 질 내에 접종한 후 세균성 질증 환자의 77%에서 질 상피세포에 유산간균이 성공적으로 착상되었고, 100%에서 증상이 호전되었으며, 33.3%의 위축성 질염 환자에서 증상 호전과 함께 질 상피세포 표면에 유산간균이 성공적으로 착상되어 우수한 치료효과를 보였다. 이상의 결과로 볼 때, 한국 여성의 질에서 분리된 유산간균총의 우점균주는 성장속도, 생존력, 항균활성에서 모두 좋은 결과를 보이며, 우량균주인 Lactobacillus crispatus KLB 46은 세균성 질증 치료의 예비적 임상실험에서 우수한 치료결과를 보여 향후 세균성 질증 치료에 있어 probiotics로서 유망한 균주로 사료된다. 따라서 본 연구는 앞으로 한국 여성에게 맞는 유산간균을 이용한 적절한 질염치료 방법 및 치료제재의 개발에 있어서 중요한 초석이 될 것으로 기대된다.

;Purpose: Lactobacilli that colonize the vagina play major roles in the inhibition of the growth of pathogens and in the maintenance of a healthy vaginal ecosystem. Lactobacilli use carbohydrates fermentatively and produce lactic acid, which results in a decrease of pH in the vagina and produce antimicribial substances like bacteriocins. Bacterial vaginosis is the most common cause of vaginitis in women of childbearing age. Antibiotic therapy gave high rates of clinical cure but studies reported recurrences in a few months, suggesting the need for lactobacilli as probiotics. The aim of this study was to analize the biologic and molecular genetic characteristics of Lactobacillus spp. isolated from vagina of Korean healthy women and to perform a pilot clinical study on the treatment of vaginitis using the best Lactobacillus strain KLB 46. Materials & Methods : Vaginal specimens were obtained from two hundred five Korean women with healthy vaginal ecosystems at Ewha Womans University Mokdong hospital. One hundred five lactobacillus strains were used for catalase test, cell surface hydrophobicity (CSH) test and antimicrobial activity test. Also we identified the species prevalence by PCR-RFLP analysis of 16S rDNA gene and performed the minimal inhibitory concentration test using 14 antibiotics to determine their patterns of antibiotic susceptibility. A pilot clinical trial of 8 bacterial vaginosis, 1 trichomonas vaginitis and 6 atrophic vaginitis using Lactobacillus crispatus KLB 46 was done by vaginal instillation (10^10-10^11 cells/ml). Vaginal sampling was done before the instillation, 3 days after the first instillation and 3 days after the second instillation. Results : One hundred five lactobacilli strains were isolated from 205 vaginal samples. All isolates were Gram-positive, rod-shaped and catalase-negative. All isolates showed high CSH and 61% of the isolates had higher CSH. Isolated lactobacilli exhibited some degrees of antimicrobial activity against the indicator strain and KLB 46 showed the highest antimicrobial activity. L. acidophilus and L. crispatus were the most prevalent species by PCR-RFLP analysis of their 16S rDNA gene (L. acidophilus and L. crispatus, 51 %; L. gasseri, 14 %; L. fermentum, 10 %; L. jensenii, 9 %; L. plantarum, 9 %; L. reuti, 4 %; L. casei and L. rhamnosus, 3 %). And PCR-RFLP analysis suggested that KLB 46 was L. crispatus. Isolated KLB strains were susceptible to penicillin, erythromycin but resistant to metronidazole, gentamicin, kanamycin, streptomycin and ofloxacin. The clinical study showed that the vaginal epithelial adherence rate was high as 77% for bacterial vaginosis and 33.3% for atrophic vaginitis. Conclusion : The predominating lactobacilli were Lactobacillus crispatus and Lactobacillus acidophilus in Korean women's vaginas. Although further study would be needed, Lactobacillus crispatus KLB 46 is a good candidate of suitable probiotics for bacterial vaginosis.