Matrix metalloproteinases 유전자 발현 조절에 의한 caffeic acid phenethyl ester의 암 전이 억제 효능에 관한 연구

Abstract

대부분의 암환자의사망원인은 초기종양으로부터 혈액을 통한 전이가 주된 원인이다. 암세포의 전이에는 세포와 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)간의 상호작용, 세포간 유착 (intercellular adhesion)과 ECM의 분해 등을 포함하는 여러 단계를 요구하게 된다. 특히, 본 연구에서는 암의 침윤과 전이에 관여하는 여러 단계 중 ECM의 분해에 초점을 맞추고 여기서 가장 중요한 역할을 하는 matrix metalloproteinases (MMPs)에 대한 연구를 시도하였다. MMPs의 활성은 유전자 발현 (gene expression), 비활성 효소의 활성화 과정 (proenzyme processing), 효소활성의 억제 (inhibition of enzymatic activity)에 의해 조절되는 것으로 알려져 있으며 인간의 MMPs 중 gelatinase A (MMP-2) 및 gelatinase B (MMP-9)는 ECM의 주요성분인 collagen, 특히 collagen type IV를 분해하는 주요 효소로 알려지면서 암세포에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현조절 물질 및 기전에 대한 관심이 점차 높아지고 있다. 꿀벌로부터 얻어진 천연물질인 caffeic acid phenethyl ester (CAPE)는 항염증제, 항바이러스제, 항암 활성 등 여러가지 생리활성으로 널리 알려져 있으며 본 연구에서는 MMP-2, -9 뿐만 아니라 matix 분해와 proMMP-2 activation에도 관여하고 있는 membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1-MMP)와 내재성 저해제인 tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 (TIMP-2)의 유전자 발현에 미치는 영향도 살펴보았다. HT1080 세포(human fibrosarcoma cell)에서 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)법으로 MMP-2, -9, MT1-MMP와 TIMP-2의 유전자 발현에 대한 CAPE의 영향을 조사한 결과, 모두 농도 의존적으로 mRNA level을 저해하는 것으로 나타났다. 특히 MMP-9에 대한 mRNA level은 CAPE 20㎛ 농도에서도 강한 저해활성을 나타냄으로써 MMP-9의 저해가 CAPE의 전이 억제효능과 관련하여 주요한 역할을 할 것으로 추측된다. 이러한 결과들로부터 CAPE는 암세포에서 MMPs와 TIMP-2 유전자 발현을 억제함으로써 암 침윤 및 전이를 저해한다고 볼 수 있다. MMP-9의 전사조절 기작을 밝히기 위하여 MMP-9 promoter region내에 존재하는 NF-κB binding site에 대한 binding activity를 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)로 확인한 결과 2, 24시간 처리한 HT1080 세포로부터 얻은 nuclear extract 모두에서 농도 의존적으로 binding activity가 증가하는 것으로 나타났으며 이로부터 CAPE의 MMPs 유전자 down-regulation이 NF-κB independent pathway를 따르는 것으로 보이며 다른 전사조절인자들에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다. Zymography를 통하여 CAPE의 MMP-2, -9 발현에 대한 영향을 조사한 결과 대조군에 비하여 농도 의존적으로 gelatinase활성이 감소하는 것으로 나타났으며 fluorometric analysis에서 MMP-2 효소 활성에 대한 저해 효능을 살펴본 결과 CAPE에 의해 MMP-2가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 CAPE가 암세포의 이동성, 침윤성 등에 미치는 영향을 알아보기 위해 여러가지 bioassay를 통해 연구를 진행한 결과 cell migration과 colony formation 및 matrigel과 type I collagen을 이용한 motility, invasion 활성을 효과적으로 저해 하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 CAPE는 MMPs 유전자 및 단백질 발현과 활성을 억제하고 또한 암세포의 침윤, 전이 등을 저해함으로써 천연물 유래의 효과적인 암전이 억제제의 개발에 유효하게 이용될 수 있을 것이다. ;Metastasis is a major cause of death among cancer patients. The metastasis of cancer cells requires several sequential steps including changes in cell-ECM (Extracellular Matrix) interaction, intercellular adhesion, and degradation of ECM. In modulation of metastasis of cancer cells, we focused on the study of the degradation of ECM. Matrix metalloproteinases (MMPs) play an important role in tumor invasion and metastasis by extracellular matrix degradation. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE), a natural product produced from honeybee, has been known as anti-inflammatory, antiviral, and anticancer properties. In this study, CAPE demonstrated the inhibitory effects of metastasis and invasiveness of tumor cells. We examined the effect of CAPE on MMPs (MMP-2, -9, MT1-MMP) and TIMP-2 gene expression in HT1080 cells. Dose-dependent decreases of MMPs and TIMP-2 mRNA levels were observed in CAPE-treated HT1080 cells as detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). These results suggest that CAPE inhibits tumor cell invasion and metastasis by suppression of MMPs and TIMP-2 in tumor cells. In order to clarify the transcriptional regulatory pathway, we investigated the role of nuclear factor-ĸB (NF-ĸB) in the expression of MMPs by CAPE in HT1080. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) demonstrated that nuclear extracts from HT1080 cells treated with CAPE showed a dose-dependent increase in binding activity to the NF-ĸB consensus sequences. These results indicate that CAPE downregulates MMPs expression in HT1080 cells through the NF-ĸB-independent pathway. Gelatin zymography showed a significant down-regulation of MMP-2, -9 expression in HT1080 cells treated with CAPE compared with controls. In fluorometric analysis, CAPE-treated HT1080 cells exhibited inhibition of MMP-2 activity in dose-dependent manner. In addition, CAPE inhibited cancer cell migration and colony formation, and also exhibited the inhibitory activities of invasion and motility through a matrigel and type I collagen assay. These results suggest that CAPE might be an effective natural product inhibiting tumor cell invasiveness and metastasis by suppression of MMPs in tumor cells.