The Dual function of AHNAK in cell proliferation

Abstract

AHNAK is a protein of an exceptionally large size (700kDa) that contains 36 central repeated units (CRUs). Each unit has at least 80% identity to others. Based on this unique structure, AHNAK has been proposed to be a scaffolindg protein in cellular signaling. The biochemical properties of AHNAK have not been studied in detail yet. We have examined regulatory mechanisms of intracellular AHNAK and found that it has dual function in cell growth. In Part I, the essential role of AHNAK in cell growth will be described. AHNAK interacts and activates PLC and PKC in response to the mitogenic stimulus involving PMA and bradykinin. We have recently shown that phospholipase C-g (PLC-g) is activated by the four central repeated units (4CRUs) of AHNAK protein in the presence of arachidonic acid. Here, we demonstrate that the four central repeated units (4CRUs) of AHNAK act as a scaffolding motif networking PLC-g and PKC-α. Specifically, 4CRUs of AHNAK bind and activate PKC-a which in turn stimulates the release of arachidonic acid near where PLC-g1 is localized. Moreover, 4CRUs of AHNAK interacted with PLC-g and the concerted action of 4CRUs with arachidonic acid stimulated PLC-g activity. Stimulation of NIH3T3 cells expressing 4CRUs of AHNAK with PMA resulted in increased generation of total inositol phosphates (IP_(T)) and mobilization of the intracellular calcium. PMA-dependent generation of IP_(T) was completely blocked in NIH3T3 cells depleted of PLC-g1 by RNA interference. Furthermore, bradykinin, which normally stimulated PLCb isozyme resulting in the generation of a monophasic IP_(T) within 30 sec in NIH3T3 cells, led to a biphasic pattern in generation of IPT in NIH3T3 cells expressing 4CRUs of AHNAK. The secondary activation of PLC is likely due to scaffolding activity of AHNAK consistent with the role of 4CRUs as a molecular linker between PLC-g and PKC-α. In addition, we demonstrate that 4CRUs of AHNAK protein is involved in the activation mechanisms of PKC isozymes. GST pull-down assay and immunoprecipitation experiment indicated that the four central repeated units (4CRUs) of AHNAK protein bind to PKC-α, bII, d, and z. Furthermore, 4CRUs of AHNAK activates PKC-a in the PS/DG-independent manner. Stimulation of NIH3T3 cells overexpressing 4CRUs of AHNAK with PMA resulted in the sequential activation of downstream events of PKC such as the activation of raf, MEK, and ERK. In addition, we have found that AHNAK potentiates AP-1 transcriptional activity in response to PMA. Together, these data suggest that AHNAK plays an important role in PKC signaling. In summary, AHNAK acts as a molecular linker between PLC and PKC in the intracellular signaling for cell growth in response to mitogenic signals including PMA and bradykinin. In part II, another role of AHNAK in the signaling for cell proliferation will be described. We show that AHNAK acts as a scaffolding protein between c-myc and Smad proteins in growth retardation. To investigate the cellular function of 4CRUs of AHNAK in cell growth, we established NIH3T3 cells stably expressing the four central repeated units (4CRUs) of AHNAK. Although AHNAK is known to be a PLC-g1 activator in the presence of arachidonic acid, the overexpression of the 4CRUs of AHNAK in cells resulted in growth retardation and cell cycle arrest through downregulation of c-Myc. Reduced expression of c-Myc protein resulted in a decreased expression of cyclin D2 and inactivation of CDK4 leading to dephosphorylation of Rb. Add-back expression of c-Myc in stable cell lines expressing the 4CRUs of AHNAK restored expression level of cyclin D2 and Rb phosphorylation. To verify the direct effect of AHNAK on c-Myc expression, luciferase activity assay using c-myc promoter was performed. The results indicate that AHNAK directly interacts with c-myc promoter region and regulates c-Myc expression. To prove the suppressive effect of AHNAK on tumor growth, we established SiHa tumor cells expressing the 4CRUs of AHNAK. The tumor cell lines expressing the 4CRUs of AHNAK showed a reduced colony forming activity on soft agar assay and reduced tumor mass in athymic nude mice compared with control cells. Based on these results, we conclude that 4CRUs of AHNAK are involved in regulation of cell growth through downregulation of c-Myc. To further understand the function of 4CRUs of AHNAK in this signaling, we attempted to identify various proteins which interact with CRU using the yeast two-hybrid system. Among the isolated proteins were Smads which are known to mediate TGFβ signaling. Subsequent immunoprecipitation experiments confirmed that the 4CRUs of AHNAK interact with Smad proteins. In addition, we found that 4CRUs of AHNAK colocalize with Smad2/3 in the nucleus of NIH3T3 cells in response to TGFb. Finally, we showed that AHNAK activates the transcriptional activity of Smads in TGFb signaling. These results suggest that AHNAK acts as a scaffolding protein for Smads in TGFb signaling. Based on results described in Part I and II, we propose that AHNAK plays dual function in cell proliferation as a scaffolding protein. ;AHNAK은 central region부분에 36개의 반복 단위들을 갖는 예외적으로 굉장히 큰 단백질이다. 각각의 반복 단위는 80% 동일성을 갖는다. 이 특이한 구조 때문에 AHNAK은 여러 신호에 반응해서 작동하는 세포 내의 신호전달체계내에서 scaffolding protein으로 작동할 수 있다. 그러나, AHNAK은 새로운 단백질로서, 그것에 관해서는, 생화학적 성질이 거의 알려져 있지않다. 이 논문에서, 우리는 AHNAK이 세포 내에서 작동하는 조절 기작에 관해 알아보고 그것이 세포 성장에서 이중되는 기능에 대해서 말해보고자 한다. 우선, AHNAK이 세포 성장 부분에서 어떤 신호전달과정을 거쳐 관여하는지 알아보았다. AHNAK은 PMA나 bradykinin과 같은 mitogenic stimulus 에 반응해서 PKC 그리고 PLC와 결합하고 그것들을 활성화시킨다. 최근에, 우리는 arachidonic acid존재하에서, AHNAK 부분 중에 4CRUs (four central repeated units)는 PLC를 활성화시킨다는 것을 보여주었다. 여기서 우리는 4CRUs of AHNAK이 PLC-g와 PKC-α 사이에서 scaffolding protein으로서 작용함을 말하고자 한다. 특별하게, 4CRUs of AHNAK은 PKC-α와 결합하고 활성화시키고, 활성화된 PKC는 PLC-g가 위치해 있는 근처에서 arachidonic acids가 만들어져 나오도록 자극한다. 게다가 4CRUs of AHNAK은 PLC-g와 결합해서 arachidonic acid존재하에서 PLC-g의 활성화를 증진시킨다. 4CRUs of AHNAK이 과발현된 NIH3T3 세포에서, PMA 자극을 주게 되면 전체적인 inositol phosphates (IP_(T))의 양이 증가되고 세포 내 칼슘이 증가된다. 그리고 PMA에 의해 생긴 IP_(T) 는 RNA interference를 이용해서 PLC-g를 없앤 세포에선, 완전히 방지된다. 게다가, bradykin은 30초 내에서 PLC-β를 활성화시켜서 IPT 를 증가시키며, AHNAK이 있는 세포에선, 두 번째 IP_(T) 의 증가를 가져온다. 두 번째 PLC의 활성화는, PLC-g와 PKC-α 사이에서 분자적인 연결고리로서 4CRUs of AHNAK의 scaffoloding activity때문인 거같다. 또한 우리는 4CRUs of AHNAK이 PKC isozymes의 활성화 시키는데 관여한다는 것을 설명하고자 한다. GST pull down assay와 immunoprecipitation 실험을 통해, 우리는 4CRUs of AHNAK이 PKC-α, bII, d, 그리고 z와 결합하고 있음을 보여주었고, 4CRUs of AHNAK은 PS/DG와 상관없이 PKC-a를 활성화시키는 것도 알 수 있었다. 그리고 4CRUs가 과발현된 NIH3T3 cells에서, PMA를 처리했을 경우, raf/MEK/ERK같은 PKC의 조절을 받는 하위 단계의 반응이 단계적으로 활성화 되었으며, PMA를 처리했을 경우, AHNAK은 AP-1의 transcriptional activity를 높여주었다. 요약하자면, AHNAK은 세포 성장을 조절하는 세포 내 신호전달 과정에서 PMA나 bradykinin같은 mitogenic signal에 반응해서 PLC와 PKC 사이에서 분자적 연결고리가 되어준다. 두 번째 파트에서는, AHNAK이 C-myc과 Smad 단백질 사이에서 scaffolding protein으로 작용해서 세포 성정 저해를 일으킬 수 있다는 것을 밝히고자 한다. 세포 성장시, 4CRUs of AHNAK의 세포 내 기능을 더 살펴보기 위해서, 우리는 4CRUs of AHNAK 이 영속적으로 들어가 있는 세포주를 만들었다. AHNAK이 arachidonic acid 존재하에서 PLC-g를 활성화시킨다고 하여도, 4CRUs of AHNAK의 과발현은, 세포 성장 저해와 c-Myc 조절을 낮춤으로써 cell cycle 저해를 가져왔다. C-Myc이 감소되자, cyclin D2도 감소되었으며, CDK4의 불활성화를 통해서 Rb도 탈인산화가 되었다. 하지만, 이 세포에 c-Myc을 다시 넣어주게 되면, cyclin D2의 양이 다시 늘어나며, Rb 인산화도 회복되었다. 그 다음으로, 우리는 luciferase assay를 통해서 AHNAK이 c-Myc의 발현에 직접적인 발현에 영향을 줄 수 있는 지를 알아보았다. AHNAK은 직접적으로 c-Myc promotor에 결합을 하며, c-Myc의 발현을 조절한다. 그 다음으로, 종양 성장에서 AHNAK이 그것을 억제하는 지를 알아보기 위해, 우리는 종양 세포인 SiHa세포에 4CRUs of AHNAK를 과발현 시킨 세포주를 만들었다. 4CRUs of AHNAK이 과발현된 세포주는 soft agar assay에서 더 작은 conoly를 형성했고, 그것은 종양이 형성된 athymic nude mice에서 종양 크기를 감소시켰다. 이 결과들에 기반해서, 우리는 4CRUs of AHNAK이 c-Myc을 조절을 낮춤으로써, 세포 성장을 조절한다고 결론내고자 한다. 이 세포 신호 전달체계에서, AHNAK의 기능을 더 알기 위해서, 우리는 yeast two hybrid system을 통해서 CRU와 결합하는 단백질을 찾아보았다. AHNAK과 결합하는 여러 단백질 등 중에서, 우리는 TGFβ에 의한 신호전달을 매개하는Smad 단백질을 찾았다. 그리고 immunoprecipitation 실험을 통해서, 우리는 4CRUs of AHNAK이 Smad 단백질들과 결합함을 보여주었다. 이에 추가해서, 4CRUs of AHNAK은 NIH3T3 세포주에서 TGFb를 처리시, 핵으로 이동해서 그곳에서 Smad2/3와 같이 위치했다. 마지막으로, 우리는 AHNAK이 TGFb에 의한 신호전달에서, Smad의 전사조절과정을 활성화시킨다는 사실도 알게되었다. 이 결과들은 AHNAK이 TGFβ에 의한 신호전달체계에서 scaffolding protein으로서 작용함을 제안한다. 첫번째와 두 번째 부분에 서술된 결과들을 통해서, 우리는 AHNAK이 scaffolding protein으로서 세포 성장을 조절하는 신호전달체계에서 중요한 역할을 할 것임을 말하고자 한다.