고온 황화수소 및 중금속의 생물학적 제거에 관한 연구

Abstract

1. 황화수소(H_(2)S)는 각종 산업 현장이나 환경기초시설 등에서 많이 발생되는 주요 악취물질로, 황화수소를 제거하기 위해 biofiltration을 이용한 생물학적 처리방법이 주목을 받고 있다. 지금까지 개발된 황화수소 제거용 biofiltration은 대부분 중온성 미생물을 이용하므로, 고온 가스를 냉각하기 위해 열교환기 설치 및 운전에 고가의 비용이 소요된다. 또한, 고온 황화수소 가스를 처리함에 있어 고온으로 인해 수분 증발량이 크므로 건조해지기 쉽고 염이 고농도로 축적될 가능성이 있으며, 고농도 염에 의해 미생물의 황화수소 분해능이 급격하게 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 그러므로 thermobiofilter의 성능을 안정적으로 유지 관리하기 위해서는 고농도 염에 대해 내성을 가진 고온 황화수소 분해 미생물을 확보하는 것은 매우 중요하다. 따라서, 본 연구에서는 고온 황화수소 가스를 처리하기 위해 고온에서 우수한 황산화능을 발휘하면서 고농도 염에 대해 우수한 내성을 가지는 고온성 황화수소 분해 세균을 순수 분리하여 분리균주의 황산화 특성 및 염에 대한 내성을 조사하고, 분리 균주를 접종한 biofilter의 황화수소 제거 특성을 조사하였다. 고온에서 황화수소를 제거하는데 중요한 역할을 하는 호열성 세균으로 TSO3 균주를 순수 분리하였다. TSO3 균주는 Bacillus thermoleovorans (Accession no. AF385083)와 99%의 매우 높은 유사도를 보였으므로 Bacillus 속에 속함을 알 수 있었다. TSO3 균주의 황산화에 미치는 yeast extract 첨가량 및 탄소원의 영향을 조사한 결과, yeast extract를 5 g/L 이상 첨가해 줌에 따라 황산화 속도가 향상되었다. 또한, glucose와 sucrose와 같은 당성분보다는 yeast extract나 peptone과 같은 질소계 유기화합물을 첨가해 줌으로써 높은 생장속도와 황산화 활성을 얻을 수 있었다. TSO3 액상 배양액에 황화수소를 공급하여 배양한 결과, TSO3 균주는 황화수소를 SO_(4)^(2-)로 최종적으로 산화함을 확인하였고, TSO3 균주를 접종한 polyurethane biofilter의 최대 황화수소 제거속도는 203 g-S·m^(-3)·h^(-1) 이었다. 또한, 90 g/L NaCl을 첨가한 LB plate에 접종하여 90 g/L NaCl-LB 배지에서 생육이 가능한 고온·내염세균 THS61 균주를 분리하였다. 분리한 THS61 균주는 Bacillus stearothermophilus (Accession no. AJ293805)와 99%의 높은 유사도를 가진 Bacillus sp.로 동정되었다. Bacillus sp. THS61 균주는 황화수소를 황산염으로 최종적으로 산화하여 분해하였다. THS61 균주를 접종한 polyurethane biofilter의 최대 황화수소 제거속도는 213 g-S·m^(-3)·h^(-1)이었다. 이상의 결과로부터 본 연구에서 분리한 고온의 온도에서 우수한 황산화능을 보이는 TSO3 균주와 90 g/L의 매우 높은 염농도 하에서도 생장이 가능한 고온·내염성 세균 THS61 균주는 황화수소를 효율적으로 제거 가능한 탈취 세균이므로, 향후 고온 황화수소의 생물학적 제거 방법에 있어 안정적인 탈취 효율을 유지하는데 매우 중요하게 활용될 것으로 사료된다. 2. 채광 작업의 결과로 발생되는 산성 광산 배수는 심각한 수질오염문제를 야기시키는데 이러한 산성 광산 배수로부터 중금속을 제거하기 위한 방법으로 황산염 환원균 (sulfate-reducing bacteria, SRB)을 이용한 생물학적 공정이 주목 받고 있다. 황산염 환원균은 유기물을 산화하는 동안 최종 전자 수용체로서 황산염를 이용하여 황화물로 환원하는 세균으로, 이 균주에 의해 생성된 황화물은 중금속 이온과 반응하여 불용해성의 금속 황화물을 형성시키므로 중금속으로 오염된 폐수나 자연수를 복원하는데 유용하게 적용될 수 있다. 생물학적 황산염의 환원은 중금속 이온이 황산염 환원 활성을 저해하는 농도에서는 반응이 일어나지 않으므로, 황산염 환원균의 활성에 미치는 중금속 독성 정보는 중요하나, 균주에 따른 독성 범위가 매우 달라 이에 대한 정보가 부족한 실정이다. 본 연구에서는 유류로 오염된 토양으로부터 황산염 환원균를 농화 배양하여 황산염 환원균의 활성 및 중금속 침전 반응에 미치는 중금속 이온의 영향을 황산염 환원 속도를 측정함으로써 조사하였다. 본 연구 결과로부터 황산염 환원균은 단일 중금속의 경우 아연에 대해 가장 내성이 크고, 납, 카드뮴, 구리 순으로 저해를 크게 받음을 알 수 있었다. 또한, 침전된 중금속 농도와 환원된 황산염 농도로부터 metal/sulfur ratio를 계산한 결과, 중금속 종류에 관계없이 중금속의 첨가량이 증가할수록 metal/sulfur ratio이 증가하였는데, 이는 황화물과 반응할 수 있는 중금속의 많아서 중금속-황화물의 반응속도가 빨라졌기 때문인 것으로 사료된다. 이것은 황산염 환원균을 이용하여 수용액 속에 존재하는 중금속을 침전시켜 제거할 경우, 황산염 환원균 내성 범위 내에서 중금속이 고농도로 존재할수록 효율적으로 제거시킬 수 있음을 의미한다. 단일 중금속 영향에 대한 실험 결과를 바탕으로 황산염 환원균의 각 금속의 첨가 농도에 따른 내성 범위를 다섯 수준으로 구분하여 삼성분계 혼합 중금속 영향에 대한 실험조건을 도출하였고, 황산염 환원균의 황산염 환원에 미치는 혼합 중금속에 대한 영향을 규명하였다. 연구 결과, 삼성분계 혼합 중금속의 종류에 상관없이 중금속 첨가량이 증가할수록 환산염 환원이 저해를 받았다. 삼성분계 혼합 중금속을 미량 첨가했을 경우의 황산염 환원 속도는 중금속을 첨가하지 않은 경우와 거의 유사하거나 오히려 증가하는 경향을 보였으나, 고농도의 삼성분계 혼합 중금속을 첨가했을 경우는 중금속 이온의 농도가 증가할수록 급격히 감소하였고, 혼합 중금속 이온이 첨가되지 않았을 경우와 비교하여 볼 때 급격히 저하되었다. 또한, 침전된 중금속 농도와 환원된 황산염 농도로부터 metal/sulfur ratio를 구할 수 있었다. Cu^(2+), Cd^(2+) 및 Pb^(2+)의 삼성분 중금속 이온을 혼합한 배지에서는 고농도의 Cd^(2+)가 첨가되었을 때 가장 친화력이 높음을 알 수 있었고, 이를 제외한 Zn^(2)가 포함된 삼성분계 혼합 중금속의 실험에서는 Zn^(2+)가 고농도로 첨가될수록 친화력에 큰 차이가 나타남을 알 수 있었다. 이것은 황산염 환원균를 이용하여 수용액 속에 존재하는 중금속을 침전 시켜 제거할 경우, 황산염 환원균 내성 범위 내에서 고농도의 Zn^(2+)이 존재할 수록 효율적으로 중금속을 침전시켜 제거할 수 있음을 의미한다. 황산염 환원균 배양용 배지를 이용한 황산염 환원균 농화 배양액의 미생물상을 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)로 분석하여 얻은 clone JN6는 황산염 환원균에 속하는 uncultured Desulforhopalus sp. clone SB1_68와 유사도가 높았다. 이러한 결과는, clone JN6가 본 연구의 농화 배양액에서 황산염을 환원하는데 중요한 역할을 하고 있음을 시사한다. 본 연구로부터 도출된 황산염 환원균에 미치는 중금속의 영향에 관한 결과는 황산염 환원균을 이용한 산성 광산 배수 처리 공정을 개발하는데 중요한 정보로 활용 가능할 것으로 사료된다.

;1. Malodorous gas emitted from many industrial and environmental facilities under hot as well as moderate temperature conditions. For most gases, the Henry's law coefficient rises with temperature, so that less of the compound will be dissolved in water, and sorption of the compound will probably also be reduced. Therefore, to treat hot odor waste gas by them, the air should be cool to applicable temperatures. Cooling the air to ambient temperatures would be expensive. Also in treating with hot H_(2)S gas, there might be some problems that resolving power of dissolution of H_(2)S by microbes could decrease rapidly due to high concentration salt as it is apt to dry and as salt is apt to be accumulated in high concentration since humidity evaporation volume is so high due to high temperature. Therefore, in order to maintain and control the efficiency of thermphilic biofilter on a stable level, it is very important to secure microbes set to dissolve hot H_(2)S of high tolerance against high concentration salt. Therefore, this paper describes the isolation and characterization of a new heterotrophic bacterium that can oxidize H_(2)S at high temperature and high salinity. The thermophilic biofilter inoculated with Bacillus sp. TSO3 and Bacillus sp. THS61 was also investigated for treatment H_(2)S gas. A thermophilic and heterotrophic H_(2)S-degrading bacterium had been isolated from the high-temperature biofilter where hot malodorous gases were treated. As a result of the H_(2)S-degrading bacterium based on sequence analysis of 16S rDNA, the isolate was identified as Bacillus sp. TSO3 (The similarity of 16S rDNA. 99%). This bacterium could heterotrophically oxidize the reduced sulfur compounds such as H_(2)S and elemental sulfur to sulfate at 60℃. The sulfur oxidation activity of this bacterium was enhanced by the supplement with organic compounds such as yeast extract, peptone, glucose, and sucrose. Since the isolate exhibited no autotrophic growth with H_(2)S, the H_(2)S removal was judged not to be a consequence of chemolithotrophic activity. When the isolate was inoculated into a polyurethane biofilter, this bacterium could degrade H_(2)S without a lag period at 60℃. Maximum removal rate of H_(2)S in the biofilter inoculated with the isolate was 208 g-S m^(-3) h-^(1) at 60℃. Also, a thermophilic and salt tolerant bacterium had been isolated from composting microbial agent and the isolate were grown in the LB plate containing 70 g/L NaCl concentration. As a result of specific growth rate of strain THS61, this bacterium could grow at medium containing 90 g/L NaCl concentration. In consequence, this strain has been confirmed to have a very high tolerance against salts. As a result of the H_(2)S-degrading bacterium based on sequence analysis of 16S rDNA, the isolate was identified as Bacillus sp. THS61 (The similarity of 16S rDNA. 99%). This bacterium could heterotrophically oxidize the reduced sulfur compounds such as H_(2)S and elemental sulfur to sulfate at 60℃. When the isolate was inoculated into a polyurethane biofilter, this bacterium could degrade H_(2)S without a lag period at 60℃. Maximum removal rate of H_(2)S in the biofilter inoculated with the isolate was 213 g-S m^(-3) h^(-1) at 60℃. The results described above indicate that Bacillus sp. TSO3 and Bacillus sp. THS61 can be applied in thermophilic deodorizing bio-systems. 2. The potential for contamination of freshwater sources by acid mine drainage (AMD) has been well documented. AMD is highly acidic (pH ca. 2-3) and contains substantial quantities of sulfate ions. Trace quantities of heavy metal ions are also typically present in most AMD streams. Biological remediation of AMD using sulfate-reducing bacteria (SRB) is effective in reducing the sulfate concentration and neutralizing its acidity. Furthermore, most of the heavy metals present in the AMD can be precipitated as insoluble sulfides using biogenic sulfide produced due to the sulfate reduction. The reported toxic concentrations of heavy metals (to sulfate reducers) range from a few ppm to as much as 100 ppm. Trace quantities of heavy metals have also been reported to stimulate a desulfovibrio strain to increase the hydrogen sulfide production in one study. Therefore, quantification of toxic and inhibitory impact of heavy metal is vital importance. A most-probable number (MPN) test is also used by some investigator for estimation of microbial population. MPN tests are typically time consuming and cumbersome, and of low precision. Also, molecular techniques require advanced lab. facilites and skill, and cannot distinguish between viable and nonviable SRB. Therefore, the objective of this study was to determine the effect of heavy metal on sulfate reduction activity of SRB through sulfate reduction rate that could be easily measured. The SRB showed the highest tolerance against Zn^(2+), and then Pb^(2+), Cd^(2+), and Cu^(2+) in order. Zn^(2+) in aqueous solution was removed most effectively, and the SRB had the lowest affinity with Cd^(2+). And also as a result of calculating the metal/sulfur ratio from precipitated heavy metal concentration and reduced sulfate concentration, metal/sulfur ratio increased as the added quantities of heavy metal are increased regardless of any kind of heavy metals. This may be caused by rapid reaction rate of the metal/sulfur due to substantial quantities of heavy metals apt to react with sulfur. It means that heavy metals present as much as high concentration could be removed efficiently within the range of SRB tolerance in case of removal of precipitated heavy metals present in the aqueous solution by SRB. As a result of basis of tests about the effect of a single heavy metal, we have divided the tolerance range as per the addition and concentration of each metal of SRB into five levels to have experiment conditions about the effect of tri-mixed heavy metals and to investigate the influence on sulfate reduction inflicted by SRB. As a result of the study, as per the added metal volume increases sulfate reduction was hindered as heavy metal is added as much as much in terms of quantities irrespective of kinds of tri-mixed heavy metals. Sulfate reduction rate in case minor quantity of tri-mixed heavy metals is added was almost similar or preferably showed a slight increase as the same as the case where heavy metal is not added. But in case tri-mixed heavy metals of high concentration was added, the sulfate reduction rate showed a trend of sharp decrease as the concentration of heavy metal irons increased as much, and showed a rapid decrease compared with the case tri-mixed heavy metal ions were not added. And also, one could get the metal/sulfur ratio from the precipitated heavy metal concentration and reduced sulfate concentration. In the medium combined with tri-mixed heavy metal ion of Cu^(2+), Cd^(2+) and Pb^(2+), there showed the highest affinity when Cd^(2+) of high concentration was added. And in the test of tri-mixed heavy metals including Zn^(2+) except for this, there showed a great difference in the affinity as Zn^(2+) was added in high concentration. It means that heavy metals present as much as Zn^(2+) of high concentration could be removed efficiently within the range of SRB tolerance in case of removal of precipitated heavy metals present in the aqueous solution by SRB. As a result of the microbial community based on sequence analysis of 16S rDNA clone library, it was found that the dominant bacteria in the SRB consortium were similar the previous types of bacteria, Desulforhopalus sp. clone SB1_68 (The similarity of 16S rDNA. 93%). The results presented in this study can be used to develop sulfate-reduction bioreactor to remove heavy metals during acid mine drainage treatment.