식물의 rab과 rho의 GTP-binding domain을 암호화하는 유전자 조각의 분리와 특성조사

Abstract

Small GTP-binding protein은 염기서열의 유사성에 따라 크게 Ras, Rho, Ypt/Rab subfamily로 나누며 이를 통칭하여 ras superfamily라 부른다. 이 superfamily에 속하는 gene들은 GTP-binding domain에 있어서 모든 subfamily에 공통적인 sequence motif 뿐 아니라 각 subfamily에 특징적인 sequence motif를 가지고 있는데, 이를 G1-G5로 칭하며, 동물, 식물, yeast 등 모든 system에서 잘 보존되어 있다. 식물세포에서의 Rab, Rho protein의 기능을 분석하기 위한 첫단계로서 PCR을 이용한 방법으로 여러 종의 식물에서 Rab과 Rho의 GTP-binding domain에 해당하는 유전자 조각을 cloning하고 그 유전자의 특성을 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다. 1. PCR법을 이용하여 녹두, 담배, 벼, 고추 4종의 식물로부터 GTP-binding domain에 해당하는 7가지의 partial rab DNA fragments를 얻었다. 이들 clone은 Ypt/Rab family에 속하는 다른 protein들과 높은 유사성을 보이며, small GTP-binding protein의 특징적인 sequence motif(G1, G3 region)를 잘 보존하고 있다. 2. Nested PCR법을 이용하여 녹두, 담배, 벼, 마늘,Arabidopsis, Gonyaulax 등 6종의 식물로부터 GTP-binding domain에 해당하는 8가지의 partial rho DNA fragments를 얻었다. 이들 clone은 염기서열이 서로간에 매우 비슷하며, 식물에서 유일하게 알려져 있는 Rho protein인 Pisum sativum의 Rho1Ps와 yeast, animals에서 밝혀진 Rho protein들과도 높은 유사성을 보인다. 또한 Rho protein에 특징적인 motif(G2 region)이외에 small GTP-binding protein의 conserved region(G1, G3 region)을 지니고 있다. 3. 염기 서열 분석과 genomic southern blot의 결과는 녹두에서의 rab gene과 rho gene이 여러 유전자가 있어 family로 존재함을 보여준다. 즉, 식물세포의 rab과 rho 유전자의 GTP-binding domain에 해당하는 sequence는 상당부분이 동물이나 yeast의 것과 유사하며, 또한 family로 존재하는 등의 상황도 동일하여 이들 단백질의 식물에서의 기능이 동물이나 yeast에서의 기능과 유사할 가능성을 강력히 시사하고 있다.;Small GTP-binding proteins divide into three major groups : Ras, Rho and Ypt/Rab. They have the conserved regions designated G1 to G5 that are critical in GDP/GTP exchange, GTP-inducecl conformational change and GTP hydrolysis. In this study, as a first step to understand the functions of the small GTP-binding protein genes in plants, I have isolated and characterized genomic DNA or cDNA fragments encoding G1 to G3 domains of small GTP-binding protein Rab and Rho from several plant species using two different PCR-based cloning strategy. Seven rab DNA fragments were isolated from 4 different plants, mung-bean, tobacco, rice and pepper using two degenerate primers corresponding to the GTP-binding domain G1 and G3 in small GTP-binding proteins. The amino acid sequences among these rab DNA fragments are very similar(>80%) identical). Sequence comparison between these DNA fragments and other known small GTP-binding proteins shows that they belong to the Ypt/Rab family. Eight rho DNA fragments were isolated from 6 different plants, mung-bean, tobacco, rice, Arabidopsis, Allium and Gonyaulax using nested PCR method that involves four degenerate primers corresponding to the GTP-binding domain G1, G3 and G4. The rho DNA fragments cloned show more than 90% homology to each other. Sequence comparison between plant and other known Rho family genes suggests that they are closely related(67 to 82% amino acid identity). Sequence analysis and southern blot analysis of rab and rho in mung-bean suggest that these genes are encoded by multigene family in mung-bean. The facts that the amino acid sequence of G1 to G3 domain of plant Rab and Rho proteins are very similar to those of animals or yeast and these genes are commonly exist as a gene family in plants, animals and yeast are suggest that the functions of Rab and Rho proteins might be well conserved among animals, yeast and plants.