Effect of Thiol-Specific Antioxidant (TSA) on the Oxidative Stress and Development of A Reporter Vector in Candida albicans

Abstract

C. albicans는 인체에 기회감염을 일으키는 병원성 곰팡이로 점막세포감염에서 치명적인 혈행성 전신감염증까지 다양한 병증을 나타낸다. 병원성 유발 기작은 효모형에서 균사체형으로의 형태분화와 숙주의 면역시스템에 대한 방어 전략에 기인한다. 앞선 연구에서 proteomics 분석 결과 C. albicans의 효모형과 균사체 형태를 비교한 결과 병원성 균사체형으로의 형태 전환 시 다르게 발현되는 여러 단백질들을 동정하였다. 그 중의 하나가 항산화효소인 Thiol-Specific Antioxidant, 병원성으로의 형태전환 시 TSA의 많은 양이 산화형으로 전환되는 것을 발견하였다. 또한 TSA 단백질은 균사체로의 형태 전환 시 많은 양이 산화형으로 형태가 전환되는 것이 밝혀졌다. Thiol-specific antioxidant (TSA)는 면역세포인 macrophage 에 의한 산화 스트레스 조건에서 살아남는데 중요한 역할을 할 것으로 기대되어 연구를 시작하게 되었다. C. albicans 의 CaTSA1 유전자를 분리하고 4개 copies가 존재하여 세포 내 기능을 밝히기 위해 CaTSA1의 완전 결실 변이종을 제작하게 되었다. 산소를 이용해서 살아가는 대부분의 모든 생물은 세포 내 대사과정을 통해 활성산소종 (Reactive Oxygen Species，이하 ROS) 를 생성하게 된다. ROS 중의 하나인 H2O2 는 second messenger로 중요 역할을 할 뿐 아니라 외부 침입 균의 저해요인으로 작용한다. TSA1 은 antioxidant 의 역할을 하는데 본 논문에서는 이렇게 만들어진 결실 변이종으로 TSA1 gene 기능을 밝히게 되었다. 병원성 C. albicans 의 TSA1 gene은 비병원성 Saccharomyces cerevisiae 와는 달리 낮은 농도의 H2O2 에서는 내성을 가지게 되는 것을 알 수 있었다. 내성을 가진 C. albicans 는 점점 높은 농도의 H2O2를 처리 하였을 때 살아남는 수가 많은 것을 알 수 있었다. TSA1 gene 의 결실 변이종 균주들의 환원력은 wild type 에 비해 H2O2를 처리한 상황에서 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다. 이 결과로 C. albicans 의 TSA 단백질은 항산화 능력을 가진 효소라는 것 을 밝힐 수아보기 위해 Western 분석을 한 결과 H2O2에 의해 CaTsa1p 발현이 유도 되는 것을 알 수 있었고 또한 H2O2 를 제거하기 위해서 TSA 단백질이 산화되면 disulfide bond 에 의해 dimer 를 형성하는 것을 비환원 SDS-전기영동을 통해 확인하였다. C. albicans는 효모형과 균사체 형인 이형성 균이다. 병원성을 가질 때 균사체 형태를 나타나게 되는데 결실 변이종 균주들은 효모형에서는 결실 변이종이지만 성장에서는 큰 영향을 나타나지 않는다. 하지만 균사체 형태를 유도하는 배지에서 H2O2를 처리하게 되면 균사체로 가지 못하는 것을 알게 되었다. 이 또한 균사체로 형태변화를 할 때 외부 활성종에 영향을 받으면 TSA gene 은 활성산소종을 분해하려는 능력을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 또 하나의 연구는 C. albicans에서 이용 가능한 reporter vector 개발 연구이다. reporter vector 는 연구하고자 하는 gene 의 promoter 아래 부분에 reporter gene 을 연결 하여 세포내에서 위치나 발현 정도를 쉽게 측정할 수 있는 vector를 말한다. 본 논문에서는 promoter 부분을 ECE1 promoter를 unique enzyme site 로 만들어 졌기 때문에 다른 어떤 목적으로든 연구하고자 하는 promoter를 클로닝 하여 사용할 수 있으며 reporter gene 이 있어서 beta-galacotosidase activity를 측정하여 정량적으로 발현 양을 정확히 조사할 수 있고 정성적으로 발현이 되는지를 쉽게 색깔로 구별 할 수 있는 이점이 있다.;Candida albicans causes various forms of candidiasis from superficial mucosal infections the life-threatening systemic diseases, especially in immunocompromised patients, such as people with AIDS, cancer or organ trasplantation. The human fungal pathogen Candida albicans is a dimorphic fungus that can grow in yeast morphology or hyphal form depending on the surrounding environment. In a previous study, several proteins were identified that are differentially expressed in pathogenic hyphae form by comparing protein profiles between yeast and hyphae of C. albicans. The hyphae may be required for tissue penetration and therefore may have a role in pathogenesis. The ability of the pathogenic fungus Candida albicans to switch from a yest to a hyphal morphology in response the external signals is implicated in its pathogenicity. TSA1 deletion mutant strain induced the serum regime or the Lee's medium to hyphae. Growth temperature or addition of serum at lower temperatures has very little effect on the induction. In this study, investigated the role of TSA in the adaptive response the H2O2 stress. Compared with the wild type, the Δtsa mutant cell becomes more sensitive to ROS. We examined the ability of C. albicans CaTSA1 to function as an antioxidant using Δtsa null mutants. These results showed that C. albicans CaTSA1 possesses peroxidase activity and functions as antioxidant like TSA/AhpC family proteins of other species.