Characterization of the mechanism for cholecystokinin-8S on neuronal activities in the rat periaqueductal gray

Abstract

The peptide cholecystokinin (CCK) is one of major neurotransmitters modulating satiety, nociception, and anxiety behaviors. Although many behavioral studies showing anti-analgesic and anxiogenic actions of CCK have been reported, less is known about its cellular action in the central nervous system (CNS). Therefore, in this thesis, I will introduce the cellular actions of CCK-8S in rat dorsolateral periaqueductal gray (PAG) neurons that, for the past several years, I have worked for. First, using whole-cell patch-clamp recordings in slices of PAG, application of CCK-8S produced an inward current accompanied by increased spontaneous synaptic activities. The CCK-8S-induced inward current (I_(cck)) was recovered after washout and reproduced by multiple exposures. Current-voltage plots revealed that I_(cck)reversed near the equilibrium potential for K^(+) ions with a decreased membrane conductance. When several K^(+) channel blockers were used, application of CdCl₂, TEA, or apamin significantly reduced I_(cck). I_(cck) was also significantly reduced by the CCK₂ receptor antagonist, L-365,260, while it was not affected by the CCK₁ receptor antagonist, L-364,718. Furthermore, I examined the effects of CCK-8S on miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs) in order to determine the mechanism of CCK-mediated increase on synaptic activities. I found that CCK-8S increased the frequency of mEPSCs, but had no effect on mEPSC amplitude. This presynaptic effect persisted in the presence of CdCl₂or Ca^(2+)-free bath solution, but was completely abolished by pre-treatment of BAPTA-AM, thapsigargin or L-365,260. Taken together, my results indicate that CCK can excite PAG neurons at both pre- and postsynaptic loci via the activation of CCK₂receptors. These effects may be important for the effects of CCK on behavior and autonomic function that are mediated via PAG neurons. Next, using fura-2-based imaging of intracellular Ca^(2+) concentration ([Ca^(2+)]_(i)) in neurons acutely isolated from the PAG, I found that the application of CCK-8S produced an increase of [Ca^(2+)]_(i), and its effect did not desensitize. The CCK-8S-induced increase of [Ca^(2+)]_(i) was inhibited by the CCK₂ receptor antagonist L-365,260 but not by the CCK₁ receptor antagonist L-364,718. In addition, the effect of CCK-8S was eliminated by removing extracellular Ca^(2+) but not by an addition of the intracellular Ca^(2+) reuptake inhibitor, thapsigargin. Simultaneous measurements of membrane potential (whole-cell patch-clamp recording) and [Ca^(2+)]_(i) revealed that CCK-8S induced an inward current at a membrane holding potential of –60 mV along with the previous observed CCK-8S-induced increases of [Ca^(2+)]_(i). Current-voltage plots revealed that the CCK-8S-induced inward current reversed near the equilibrium potential for K^(+) ions with a decreased conductance. However, CCK-8S partially inhibited high-voltage-activated (HVA) Ca^(2+) currents. These results suggest that the CCK-8S-induced increases of [Ca^(2+)]_(i) and inward currents are caused by a depolarization with the suppression of K^(+) conductances. The evidences presented here may explain the ability of CCK to modulate the behavioral and autonomic function of the PAG. I examined the effects of CCK-8S and DAMGO on miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) in order to determine the mechanism of CCK-mediated increase on synaptic activities and correlate the mechanism between CCK receptors and opioid receptors in neurons acutely isolated from the PAG. I found that CCK-8S increased the frequency of mIPSCs, but had no effect on mIPSC amplitude. This presynaptic effect persisted in the presence of CdCl₂ or Ca^(2+)-free bath solution. On the contrary, DAMGO decreased the frequency of mIPSC, but had no effect on mIPSC amplitude. This presynaptic effect disappeared in the co-application of CCK-8S. Taken together, my results suggest that the CCK receptors in PAG neurons can facilitate the GABAergic synaptic transmission and correlate with opioid receptors on presynaptic GABA release. These effects may be important for the effects of CCK on antinociceptive function and behavior that are mediated via PAG neurons.;Cholecystokinin (CCK)는 포만감, 감각인지, 공포나 불안에 의한 행동 등을 조절하는 주요 신경전달물질의 하나로 알려져 있다. CCK를 이용한 항진통성 (anti-analgesic) 및 불안유발 행동 (anxiogenic actions)에 대한 많은 행동 실험들이 보고 되어져 있지만, 중추신경계 안에서의 세포수준의 작용들에 대하여는 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 본 논문은 흰쥐의 periaqueductal gray (PAG)지역의 신경세포를 이용하여 CCK-8S의 작용기전을 다양한 전기생리학적 기법을 통해 조사하였다. 우선, PAG slice patch-clamp recording 기법을 이용하여 CCK-8S를 신경세포에 처리한 결과 자발적인 synaptic activity가 증가함으로 인해 inward current가 유발되었다. CCK-8S에 의해 유발된 inward current (I_(cck))는 washout 이후 처음상태로 회복되었고, 여러 차례의 처리에도 유사한 반응을 나타내었다. 이러한, I_(cck) 는 K^(+) conductance가 감소되어 나타난 반응임을 current-voltage plot을 통하여 확인하였고, K^(+)channel blocker인 CdCl₂, TEA, apamin을 처리하였을 때, I_(cck)가 감소됨을 확인하였다. 또한, I_(cck) 는 CCK₂ 수용체의 antagonist인 L-365,260에 의해서도 뚜렷히 감소함을 보여주었다. CCK에 의한 synaptic activity의 증가가 어떠한 기작에 의한 것인지를 확인하기 위하여 miniature excitatory postsynaptic current (mEPSC)에 대한 CCK의 효과를 살펴 보았다. CCK-8S는 mEPSC의 amplitude는 변화시키지 않고, frequency만 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 presynaptic 효과는 CdCl₂나 Ca^(2+)-free 환경에서도 지속 되어졌으며, BAPTA-AM, thapsigargin, 그리고 L-365,260의 처리시 완전히 사라져 버렸다. 이러한 결과들은 CCK가 CCK₂수용체의 활성을 통하여 pre-와 postsynaptic 부위 모두에서 PAG 신경세포를 활성화 시킬 수 있음을 보여주는 것이다. 다음으로, fura-2를 이용한 Ca^(2+) imaging 기법을 통하여 CCK-8S 처리시 [Ca^(2+)]_(i)이 증가 되어지고, 이러한 반응은 탈감각 (desensitize)되어지지 않음을 확인할 수 있었다. CCK-8S에 의해 유발된 [Ca^(2+)]_(i)의 증가는 CCK₂수용체의 antagonist인 L-365,260에 의해서 억제 되어졌다. 또한, CCK-8S의 [Ca^(2+)]_(i) 증가효과는 세포외부의 Ca^(2+)을 제거하자 모두 사라졌으며, 세포내 Ca^(2+) reuptake inhibitor인 thapsigargin에 의해서는 영향을 받지 않았다. 막전위 (membrane potential)와 [Ca^(2+)]_(i)를 동시 측정한 결과 CCK-8S가 –60 mV에서 [Ca^(2+)]_(i) 증가와 함께 inward current를 유발시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한, CCK-8S에 의한 inward current는 K^(+) conductance가 감소되어 나타난 반응임을 current-voltage plot을 통하여 확인하였다. 그러나, CCK-8S는 high-voltage-activated (HVA) Ca^(2+) current를 부분적으로 억제하였다. 이러한 결과들은 CCK-8S에 의해 유발 되어지는 [Ca^(2+)]_(i)의 증가와 inward current 발생이 K^(+) conductance의 억제로 인한 탈분극 (depolarization)에 의한 것으로 보여진다. 따라서, 이러한 결과들을 바탕으로 PAG의 행동학적, 자율적 기능들을 조절하는 CCK의 역량을 설명할 수 있을 것으로 사료된다. CCK에 의한 synaptic activity의 증가와 CCK 수용체와 opioid 수용체간의 상호작용 기전이 어떠한 기작에 의한 것인지를 확인하기 위하여 miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)에 대한 CCK-8S와 DAMGO의 효과를 살펴 보았다. CCK-8S는 mIPSC의 amplitude는 변화시키지 않고, frequency만 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 presynaptic 효과는 CdCl₂나 Ca^(2+)-free 환경에서도 지속 되어졌다. 반대로 DAMGO는 mIPSC의 amplitude는 변화시키지 않고, frequency만 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 presynaptic 효과는 CCK-8S를 함께 처리하자 사라졌다. 이러한 결과들은 PAG 신경세포에 존재하는 CCK 수용체가 GABAergic synaptic transmission을 활성화 시킬 수 있으며, presynaptic GABA 분비에 대하여 opioid 수용체와 상호작용을 할 수 있음을 보여주는 것이다. 이러한 효과들은 PAG 신경세포에 의한 antinociceptive 기능과 행동에 대한 CCK의 역량을 설명할 수 있을 것으로 사료된다.