Roles of transforming growth factor-beta in tumor-bearing hosts : apoptosis and defective T cell-mediated immune function

Abstract

Tumor development or growth is accompanied by impaired immune responses, such as a poor proliferative response or down-regulated cytolytic T lymphocyte activity. Although recent reports have suggested that defective immune function of tumor-bearing hosts was derived from tumor, the causes of it were not yet completely understood. In the first part of this study, alterations of several signal-transducing molecules in peripheral blood T lymphocytes (T-PBL) as well as in tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from human cancer patients and their relationship with impaired host immune responses were investigated. A greater reduction in cd3ζ chain level was observed in TIL than in T-PBL from tumor-bearing hosts. cd3ζ chain reduction in T-PBL was correlated with the clinicopathological stage of tumor. Expression of protein tyrosine kinase p59^fyn was significantly reduced in T-PBL from tumor-bearing hosts. However, levels of cd3ζ chain was not correlated with T lymphocyte functions such as T lymphocytes proliferative response or allogenic target cell lysis. These findings indicate that tumor-induced defective T cell immunity was not directly mediated by alteration of signal-transducing molecules in T cells. In the second part of this study, tumor-derived factors were investigated as an immunosuppressor. Previous studies on the effects of humoral factors revealed that TGF-β was produced from tumor cells and it could induce the immunosuppression in tumor-bearing hosts. We demonstrated that plasma TGF-β was higher in patients with advanced stage of gastro-intestinal cancer than normal control. And these patients showed defective immunity included in reduction of CD3 positive population and alteration of signal-transducing molecules in T cells. The relationship between the increase of plasma TGF-β and tumor-derived immunosuppression in tumor-bearing hosts was confirmed by using a mouse tumor model. Furthermore, tumor-derived macrophages, potent immune-suppressor cells, were increased in tumor-bearing mice that had higher level of serum TGF-β. When the TGF-β activity was abrogated by administration of anti-TGF-β antibody into tumor-bearing mouse, tumorigenesis and immunosuppression were effectively prevented. These results suggest that TGF-β was presumed to be deeply associated with the growth and progression of tumor and related to immunosuppressive reaction as a humoral factor. The recent studies on the functional effects of TGF-β on lymphocytes suggested that TGF-β could trigger apoptosis as a direct suppressant of T-dependent immune response in tumor-bearing hosts. In the third part of this study, to examine this possibility, molecular mechanisms of TGF-β induced apoptosis were investigated by using the IL-2 independent cell line (CTLL2-I) isolated from the murine T cell line (CTLL-2). In the IL-2 independent cell line, Bcl-x_L seemed to play a major role as an anti-apoptosis molecule and TGF-β induced apoptosis was more enhanced than in original cell line. And caspase1 was activated by TGF-β treatment and consequently it cleaved mitochondrial Bcl-x_L in IL-2 independent T cell line. The cleavage of Bcl-x_L mediated disruption of membrane potential and triggered apoptosis. TGF-β induced DNA fragmentation and cleavage of Bcl-x_L were inhibited by pretreatment of tetra peptide caspase1 inhibitor, YVAD.cmk. These findings demonstrate that TGF-β induces cell death in murine T-cell through cleavage of Bcl-x_L and caspase 1 may act as an important executor in that process. In summary, the defective immune function of tumor-bearing hosts can be induced by progressively growing tumor, because tumor produces the immunosuppressive factors such as TGF-β to escape the host s immunesurveillance. This tumor-derived TGF-β can modulate the T cell immunity as it mediates the apoptosis or alteration of signal-transducing molecules through dysfunctional macrophages.

Key word : TGF-β, Bcl-x_L, caspase, CTLL-2, apoptosis, signal transducing molecules, PBL, TIL, suppressive macrophages ; 진행성 암 숙주의 경우 암의 진행에 따라 종양세포에 의한 suppressor factor의 생성, suppressive cells의 증식, specific cytotoxic T cell clones의 소멸, lymphokine 생성저하 등으로 인해 숙주 면역능의 전반적인 저하가 보고 되고 있다. 이에 본 연구에서는 TCR-CD3 복합체를 통한 signal transduction의 장애가 숙주의 면역능 저하 특히 T 세포의 기능 저하에 기여할 것이라는 가정 하에, 진행성 암 환자를 대상으로 그들의 말초혈액 내 T세포와 종양에 침윤된 림프구들을 분리하여 signal transduction에 중요한 역할을 담당하는 TCR-CD3 ζ chain과 p59^fyn, p56^lck 등의 PTK 발현을 조사하였다. 그 결과 암의 진행에 따라 숙주의 T 세포의 signal transduction molecules 발현에 장애가 있음을 알 수 있었다. 그러나 이러한 T 세포 내 signaling molecules의 발현 저하 또는 상실은 TCR-CD3를 통한 T 세포의 증식능 또는 살해능 저하와는 상관관계를 보이지 않아, T 세포의 signal transduction molecules 장애가 보이지 않는 환자의 경우에도 T 세포의 기능이 크게 저하되어 있음을 확인하였다. 이러한 결과들은 종양에 의한 숙주의 T 세포 면역 기능 저하가 단순히 TCR-CD3를 통한 signal transduction 장애에 의한 것이 아니라는 것을 의미하며, 숙주의 면역기능을 저하시킬 수 있는 다른 요인의 존재에 대한 가능성을 제시해 주었다. 이와 같은 가능성을 조사하기 위해 본 연구에서는 많은 종양세포에서 생성되어 다양한 세포, 특히 면역세포의 성장과 증식을 억제하는 물질인 TGF-β 주목하였다. 진행성 암 환자를 대상으로 선행된 연구에서와 같은 방법으로 T세포 signal transduction pathway의 장애를 조사하여, 이를 환자의 말초혈액 내 TGF-b 치와 비교 분석 하였다. 그 결과 종양의 진행과 혈청 내 TGF-β의 증가 간에 양성의 상관관계가 형성됨을 확인 하였고, CD3-ζ 또는 p59fyn 과 같이 TCR-CD3 복합체에 직접 association된 T 세포의 signal transduction molecules의 alteration과 증가된 TGF-β 간에도 상관관계가 있음이 밝혀졌다. TGF-β와 종양 숙주의 저하된 T 세포 면역기능과의 상관관계는 mouse tumor model을 수립하여 확인하였으며, 이 mouse model을 통해 종양이 진행되고 혈청 내 TGF-β가 증가할 수록 suppressive macrophages가 mouse spleen에 축적됨이 조사 되었는데 이러한 macrophages는 직접적인 접촉에 의해 T 세포의 TCR-CD3 ζ chain의 alteration을 초래할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 종양의 진행과 숙주의 T 세포 기능 억제에 미치는 TGF-β의 영향을 anti-TGF-β antibody로 neutralize하고자 anti-TGF-β antibody를 낮은 농도로 종양주위에 국소적으로 또는 복강에 전체적으로 주사하였다. TGF-β에 대한 antibody를 복강에 주사한 경우 anti-tumor effect를 볼 수 없었던 것에 반해 종양주위에 국소적으로 주사한 경우에는 종양의 성장이 크게 억제되며, suppressive macrophages의 축적과 T cell signaling molecules의 alteration도 크게 저하되었다. 이와는 반대로 종양세포의 배양액을 농축하여 TGF-β의 source로 종양주위와 복강에 주사한 경우에는 복강에 TGF-b를 주사함으로써 종양의 진행이 크게 빨라졌다. 이러한 결과들로 종양세포에서 생성되는 TGF-β가 종양 형성과 진행에 suppressive macrophages를 증가시키는 방법을 통해 또는 직접적인 방법으로 연관되어 있음을 인지하고, TGF-β에 의한 직접적인 T 세포 면역 기능 중 하나가apoptosis 일 가능성을 조사하였다. IL-2 의존적인mouse normal T cell line (CTLL-2) 에서 IL-2 비의존적인 cell line(CTLL2-I) 을 분리한 뒤 TGF-β를 처리 apoptosis 유도하였다. 모세포인 CTLL-2에 비해 Bcl-x_L이 major anti-apoptotic molecule인 CTLL2-I에서 TGF-β induced apoptosis가 증가됨을 확인하였다. 이러한 현상은 TGF-β 처리에 의한 T 세포의apoptosis가 procaspse 1이 caspase 1으로 activation되고, csapase 1에 의한 Bcl-x_L의 cleavage를 거쳐 유발되기 때문임을 실험을 통해 확인하였고, 더불어 mitochondria에 존재하던 Bcl-x_L이 cleavage되므로 인해 mitochondrial membrane potential의 disruption이 초래되어 apoptosis가 더 심화된다는 것을 알게 되었다. 이제까지의 결과들로 종양세포에서부터 생성되는 TGF-β에 의한 T 세포 기능 저하 과정을 두 단계로 나눌 수 있었다. 즉, 종양의 형성 초기에는 apoptosis와 같은 과정을 통해서 종양 주변으로 유입되는 림프구에 작용하고, 중기나 말기에는 macrophage를 통해 숙주 내의 T세포를 전반적으로 down-regulation 할 것으로 예상된다.

중요 단어 : 진행성 암 환자, TGF-β, Bcl-x_L, caspase, CTLL-2, apoptosis, signal transduction molecules, PBL, TIL, suppressive macrophages