Roles of MAPKs in Zn2+ -induced cell death in differentiated PC12 cells

Abstract

뇌의 허혈증, 발작과 같은 신경세포에 대한 충격은 신경세포의 사멸을 일으킬 수 있다. 이러한 허혈증과 발작에 있어서, Ca2+ 이 접합 후 신경의 glutamate 수용체 활성화를 통해서 중요한 역할을 담당함은 많이 연구 되어져 있다. 한편 최근에 흥분성 신경 말단에서 유리되는 고농도의 Zn2+ 가 접합 후 신경 말단에 작용하여 세포의 사멸을 유도함이 밝혀짐에 따라 현재 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나, Zn2+ 가 세포 사멸을 유도하는 기전에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지 않은 상태이다. Zn2+에 의한 세포 사멸 과정에는 현재까지 energy 생성을 억제하거나, 활성 산소 종의 증가가 보고되어 있다. 활성 산소 종은 뇌졸중, 허혈증과 같은 퇴행성 신경질환에 있어서 증가됨이 보고 되어져 있으며, MAPK pathway를 포함한 많은 세포 내 신호 전달계를 활성화 시킨다. MAPK family는 JNK, ERK 및 p38 MAPK로 구성되어지는 serine과threonine protein kinase로서 세포의 성장과 분화 및 사멸에 있어 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 이중 JNK와 p38 MAPK의 경우PC12를 포함한 많은 세포의 스트레스와 사멸에 있어 중요한 역할을 담당하여서 활성화 되면 세포의 사멸을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 반면에 ERK의 경우 세포의 분화, 생존 및 증식에 관여함이 연구되어져 있다. 그러나 최근에 있어 ERK의 활성화가 세포의 사멸에 관여한다는 보고가 있어서 이러한 ERK의 역할에 대해서는 논란이 있는 상태이다. 본 실험에서는 신경 세포로 분화 시킨 PC12 세포 주에서 Zn2+에 의해 유도되는 세포 사멸 과정에서의 MAPK pathway와 활성 산소 종의 역할을 규명하였다. 세포내의 Zn2+ 의 증가는 MAPK family 중JNK와 ERK의 활성을 증가 시켰으며 p38 MAPK는 활성화 시키지 못했다. 또한 JNK를 활성화 시키는 kinase인 SEK1의dominant negative mutant (SEKAL ) 를 과잉 발현 시켜서 SEK1의 활성을 억제한 결과 Zn2+에 의한 세포 사멸을 감소 시키지 못했다. 한편 ERK의 활성 억제제인 PD98059를 처리하였을 때는 Zn2+에 의해 유도 되는 세포사멸이 저해됨을 확인하였다. 따라서 Zn2+에 의해 활성화된 MAPK 중 ERK 만이 Zn2+에 의한 세포 사멸에 관여함을 확인 할 수 있었다. 또한 이러한 ERK 의 활성화는 Ras에 의존적으로 일어나며, Protein kinase C (PKC) 나 phosphatidylionositol-3 kinase (PI-3K)와 비의존적으로 일어남을 확인하였다. 세포 내 Zn2+의 증가는 활성 산소 종을 증가 시켰으며 항 산화 물질들을 처리 하여 활성 산소 종의 증가를 저해했을 경우 세포 사멸이 저해 됨을 확인 하였다. 또한 항 산화 물질 처리 시에 ERK의 활성화가 억제 되었으며, ERK 억제제인 PD98059를 처리했을 경우에는 Zn2+에 의한 활성 산소 종의 증가를 억제 시키지 못했다. 따라서 신경 세포로 분화된 PC12 세포 주에서Zn2+에 의한 활성 산소 종의 증가가 ERK의 활성화를 통해 세포의 사멸을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 본 실험의 결과는MAPK 중 ERK의 활성화가 PC12 세포 주에서 세포의 사멸 과정을 저해 한다는 기존의 보고와는 상반 되는 결과이다. 이러한 상반된 결과는 ERK활성화의 정도와 활성화의 기간에 따라 세포의 사멸을 억제 시킬지 촉진 시킬지를 결정하기 때문으로 사료된다.

핵심어 : 신경 세포, 사멸, Zn2+, MAPK, JNK, ERK, PC12 세포 주, 활성 산소 종 ; Recent studies have provided evidence that Zn2+ plays a crucial role in ischemia- and seizure-induced neuronal death. However, the intracellular signaling pathways involved in Zn2+-induced cell death are largely unknown. In the present study, I investigated the roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), such as c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 MAPK and extracellular signal-regulated kinase (ERK), and of reactive oxygen species (ROS) in Zn2+-induced cell death using differentiated PC12 cells. Intracellular accumulation of Zn2+ induced by the combined application of pyrithione (5 mM), a Zn2+ ionophore, and Zn2+ (10 mM) caused cell death and the activation of JNK and ERK. However, p38 MAPK was not activated by Zn2+ application. Preventing JNK activation by the expression of dominant negative SEK1 (SEKAL) did not attenuate Zn2+-induced cell death, while the inhibition of ERK with PD98059, a specific inhibitor of ERK activating kinase, MEK1/2 significantly prevented cell death. Furthermore, expression of dominant negative Ras mutant (RasN17) abolished not only the activation of ERK but also cell death in neuronally differentiated PC12 cells, suggesting that Ras is necessary to activate ERK by Zn2+ application. These results indicate that ERK activation is simply not a marker but an active constituent of cell death program. I also demonstrated that protein kinase C (PKC) and phosphatidylinositol (PI)-3 kinase pathways had little effect on Zn2+-induced ERK activation using specific inhibitors, GF109203X, wortmannin and LY294002. Intracellular Zn2+ accumulation resulted in the generation of ROS, and antioxidants such as N-acetyl-cysteine (NAC), glutathione (GSH) or membrane permeable superoxide dismutase (SOD) mimic, manganase (III) tetrakis (4-benzoic acid) porphyrin (MnTBAP) prevented both the ERK activation and the cell death induced by Zn2+. However, PD98059 pretreatment could not prevent reactive oxygen species (ROS) generation, thus suggesting that Zn2+-induced ERK activation is downstream of ROS accumulation. Therefore, I conclude that, while Zn2+ activates both JNK and ERK in MAPKs, only ERK contributes to Zn2+-induced cell death, and that ERK activation is mediated by ROS via the Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathway.

Key words : Zn2+, cell death, mitogen-activated protein kinases (MAPKs), JNK, ERK, ROS