활성산소종이 조혈모세포의 분화에 미치는 영향

Abstract

Superoxide anion(O₂^-)과 hydrogen peroxide(H₂O₂)와 같은 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)은 일반적인 호흡 과정의 부산물로서 세포내에서 독성물질로 작용한다고 많이 알려져 왔지만, 최근에 ROS는 외부 자극에 의하여 세포막에 존재하는 수용체를 통한 일시적인 생성을 보이며, 세포신호전달의 이차 선호전달 물질로서 작용할 것이라는 연구 결과가 나오고 있다. 또한 ROS가 세포의 분화에 영향을 미친다고 하는 보고는 있으나 아직 ROS의 대상물질이나 신호전달 과정에서의 그 역할은 명백히 밝혀져 있지 않다. 세포 분화 과정에 있어서 ROS의 역할을 규명하기 위하여, phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 처리하면 megakaryocyte로 분화한다는 것이 이미 잘 알려져 있는 chronic myelogeneous leukemia cell line인 K562 세포를 도입하였다. K562 세포에 PMA를 처리하여 megakaryocyte로 분화하는 자극을 주었을 때 5분 이내에 ROS 생성이 증가했다가 다시 기본 수준으로 떨어지는 것을 관찰하였다. ROS는 세포내 특정 단백질의 cysteine sulfhydryl group(Cys-SH)을 cysteine sulfenic acid(Cys-OH)나 disulfide residues로 만들 수 있는 약산화제 역할을 한다. 이렇게 대상물질의 활성부 위에 있는 Cys-SH는 biotin-labeled iodoacetic acid(IA-biotin)에 의해 쉽게 변형이 될 수 있는 반면 ROS에 의해 산화된 형태인 Cys-SOH는 그 대상물질이 IA-biotin에 의해 변형이 될 수 없게 된다. 이러한 사실을 이용하여 K562 세포에서 PMA를 처리했을 때와 처리하지 않았을 때 IA-biotin으로 대상물질을 표지한 결과, 4개의 각기 다른 표지된 단백질을 확인할 수 있었다. 약 72, 60, 50, 39 kDa의 분자량을 가지는 이 단백질들을 분리 · 정제한 후 MALDI-TOF MS로 분석한 결과, protein disulfide isomerase(PDI), thioredoxin reductase(TR), α-enolase, WISP3라는 것을 알 수 있었다. 앞으로 이 네가지 물질이 세포의 분화에 미치는 영향을 조사할 필요가 있다. ; Although superoxide anion(O₂) and hydrogen peroxide(H₂O₂) are generally considered to be toxic by-products of respiration, recent evidence suggests that the production of these reactive oxigen species(ROS) might be an integral component of membrane recepter signaling on the cellular differentiation. However, the role of target molecules by ROS remains to be solved. To investigate the role of ROS in cellular differentiation, PMA-treated K562 was engaged. PMA induced to differentiate K562 cells to megakaryocytes and stimulated to increase ROS within 5 miniutes in K562 cells and then decreased to basal level. ROS is a mild oxidant that can oxidize specific protein sulfhydryl groups, producing proteins with cysteine sulfenic acid (CysS-OH) or disulfide residues. Very few proteins are expected to have a Cys-SH that is susceptible to oxidation by ROS in cells because oxidation requires that the target Cys-SH have a pKa below 7.0. The target Cys-SH in active center is easily modified by biotinylated iodoacetic acid (IA-biotin), whereas the oxidation of Cys-SH (Cys-SOH) by ROS prevented modification of the catalytic cysteine of target molecule by IA-biotin. To identify the target molecules by ROS in cells, we stimulated K562 cells with or without PMA and then added to IA-biotin. SDS-PAGE from to reaction mixtures revealed four different biotin-labled proteins with apparent molecular weight of 72, 60, 50, 39 kDa. We will discuss the effect of four different target molecules on differentiation of K562 cells