Role of Bcl-2 in invasion and metastasis of H157 non-small cell lung cancer cells

Abstract

세포사멸을 억제하는 대표적 유전자인Bcl-2는 비소세포성폐암에서 20-70% 과발현되고 있을 뿐만 아니라 암 전이에 관련되어 있다고 알려져 있다. 그러나, Bcl-2의 발현이 비소세포성폐암의 전이에 미치는 영향과 그 분자생물학적 기전은 잘 알려져 있지 않다. 본 연구는 Bcl-2가 폐암의 75%를 차지하는 비소세포성폐암의 전이에 미치는 영향과 분자 생물학적 작용기전을 규명하기 위하여 Bcl-2를 과다발현 하는 H157비소세포성폐암세포주 클론을 (H157/Bcl-2) 수립하였다. Bcl-2의 과다발현이 in vitro에서의 전이에 중요한 침윤에 미치는 영향을 알아보기 위하여 matrigel 침윤분석을 수행하였다. 모세포주인H157 및 pCI-neo 벡터를 주입한 H157/C 대조군에 비해 Bcl-2 발현이5배 이상 높은 H157/Bcl-2 클론에서 Matrigel 투과성이 15배 높음을 관찰하였다. 또한 자발적인 전이에 미치는 영향을 살펴보기 위한 동물실험에서도 H157/Bcl-2를 BALB/c nude mouse의 발바닥에 주입한 경우 원발부위의 종양 크기는 비슷하였지만 H157/Bcl-2를 주입한 쥐가 대조군에 비해 4배 높은 폐 전이성을 보였다. Bcl-2의 과다발현에 의한 전이성의 증가에 관여하는 작용기전을 규명하기 위하여 전이 과정에 중요한 인자로 알려진 신혈관 생성 관련 인자인 vascular endothelial growth factor (VEGF), basal fibroblast growth factor (bFGF)와 침윤관련인자인 matrix metalloproteinases (MMPs)들의 발현을 H157과 H157/Bcl-2 세포주에서 조사한 결과 MMP-2만 발현이 증가함을 확인할 수 있었다. Bcl-2에 의해 MMP-2의 mRNA와 단백질 의 발현이 유도됨을 확인하였다. 또한 Bcl-2가 MMP-2 의 발현을 증가시킬 뿐 아니라 활성화도 촉진시킴을 젤라틴 zymography를 통하여 확인하였다. 이와 같은 Bcl-2에 의한 MMP-2 발현증가에 관여하는 분자적 작용기전을 규명하기 위하여 nuclear run-on 과 MMP-2 promoter를 포함하는 luciferase reporter assay을 수행한 결과 Bcl-2가 MMP-2 유전자의 전사율을 증가시킴을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 Bcl-2 침윤과 전이에 중요한 MMP-2 유전자의 전사와 MMP-2 단백질의 활성을 증가시킴으로써 비소세포성폐암의 침윤과 전이를 증가시킴을 알 수 있었다. 본 연구결과에 입각하여 Bcl-2에 의한 MMP-2의 발현 유도가 비소세포성폐암의 전이를 촉진함으로써 종양의 악성화를 초래할 수 있다고 사료된다. ; Overexpression of Bcl-2 was reported approximately 20-70% of non-small cell lung cancer (NSCLC) and was known to be associated with malignant progression. However, molecular mechanisms involved in the malignant progression and metastasis of NSCLC remain unknown Thus, we have investigated the role and its underlining mechanism of Bcl-2 on the invasive and metastatic potential in NSCLC. To investigate the role of Bcl-2 on malignant behavior of NSCLC, we have established a human NSCLC cell line overexpressing Bcl-2 (H157/Bcl-2). Bcl-2 mRNA and protein were 12- and 5-fold overexpressed, respectively in H157/Bcl-2 transfectants compared to either H157 or H157 expressing pCI-neo vector (H157/C). In vitro invasive capability of H157/Bcl-2 was investigated by using a matrigel-coated chamber, and H157/Bcl-2 showed 15-fold higher invasive capability than those of H157 and H157/C. Metastatic potential of H157/Bcl-2 in vivo was determined by injecting NSCLC cells into the footpad of BALB/c nude mice. While there was no significant difference in the size of the primary tumor formed in the leg of mice, the number of pulmonary metastatic nodules formed by H157/Bcl-2 cells was 16-fold increased compared to that of controls. To explore whether increase in invasion and metastatic potential by Bcl-2 in H157 cells is associated with matrix metalloproteinases (MMPs) induction, expression of MMPs were examined by RT-PCR. Only the expression of MMP-2 among twenty MMPs was dramatically increased in H157/Bcl-2. Induction of MMP-2 mRNA and protein by Bcl-2 was examined. Furthermore, Bcl-2 activated the latent-MMP-2 in H157/Bcl-2. To further explore molecular mechanism(s) involved in the induction of MMP-2 by Bcl-2, we performed nuclear run-on assays. Transcription rate of MMP-2 in H157/Bcl-2 was 6-fold higher than that of H157. Bcl-2 also transactivated the reporter containing human MMP-2. The level and DNA binding activity of transcription factor polyomavirus enhancer activator 3(PEA3) was induced in the nuclear extracts of H157/Bcl-2. In conclusion, Bcl-2 promoted the in vitro invasion and in vivo metastatic potential in NSCLC cells through inducing transcription of MMP-2 gene. Taken together, our findings suggested that these enhanced expression and activation of MMP-2 by Bcl-2 may contribute to malignant phenotype of NSCLC cell.