Gerbil의 일과성 전뇌 허혈모델에서 해마의 지연성 신경세포손상에 대한 7-Nitroindazole의 영향

Abstract

Nitric oxide (NO)는 혈관의 평활근을 이완시키고, 혈소판의 응집을 막으며, N-methyl-D-aspatate(NMDA) 수용체를 활성화하는 작용을 하기 때문에 허혈병변의 발생기전에 관여하는 것으로 알려졌다. 중추신경계의 허혈병변에서도 NO의 역할에 대한 많은 연구가 진행되었고 NO의합성에 관여하는 다양한 nitric oxide synthase (NOS)억제제를 이용한 연구에서 서로 다른 결과가 보고되었다. 본 연구는 gerbil에서 양측 경동맥을 10분간 차단한 후 재관류 시켜 일으킨 일과성 전뇌 허혈모델을 이용하여, 선택적인 neuronal NOS (nNOS)억제제인 7-nitroindazole (7-NI)을 허혈 직후와 40분 후에 투여한 경우에 해마에서 일어나는 신경세포와 변화를 허혈 후 1일과 3일에 관찰하여 7-NI가 지연성 신경세포 손상의 진행에 미치는 영향을 보았다. 실험동물은 네 군으로 나누었고 제 1군은 대조군으로 양측 총경동맥을 10분간 차단하고 재관류 시켰으며, 제 2군은 전뇌 허혈 후에 즉시 매개체(vehicle, peanut oil)를 복강 내 투여하였다. 제3군은 전뇌 허혈 직후에 7-NI 60mg/kg을 투여하였고, 제4군은 7-NI 60mg/kg를 양측 총경동맥 결찰 40분 후 복강 내 투여하였다. 실험 결과에서 대조군은 모두 1일과 3일에 subiculum-CAI과 CA2-3의 신경세포가 전형적인 지연성 신경세포 손상을 보였다. 그에 비교하여 제3군에서는 1일에는 subiculum-CAI과 CA2-3에서 신경 세포의 변화가 대조군과 비슷했지만 3일에는 신경세포의 변화가 현저하게 적어서 7-.NI에 의한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 제4군에서는 subiculum-CAI의 신경세포는 1일과 3일에 대조군과 비슷했지만 CA2의 신경세포는 1일과 3일에 대조군보다 적은 손상을 보였다. 또한 제 3군은 제 4군에서 비해서 3일에 발생한 subiculum-CAI신경세포의 변성이 통계학적으로 유의하게 적었다. 해마다 자연성 신경세포 손상이외에 국소경색이 제2군의 6마리 중 한 마리와 실험군(제3군과 제4군) 21마리 중 5 마리에서 발생하였다. 이러한 결과로 제3군의 경우 subiculum-CAI과 CA2-3에 있는 신경세포에서 발생하는 지연성 신경세포 손상을 억제하는 신격보호효과가 있는 것과 지연성 신경세포 손상에는 nNOS가 관련하는 것을 확인하였다. 반면에 제4군에서 subiculum-CAI에 있는 신경세포가 대조군과 비슷한 변화를 보이고 제3군보다 유의하게 심한 손상을 보여서 NOS억제제를 투여하는 시간이 지연성 신경세포 손상을 억제하는 데 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 또한, 7-NI를 허혈 직후에 투여하는 경우에 1일에는 대조군과 비슷한 변화가 보이고 3일에 신경세포의 손상이 적은 소견으로 1일에 광학현미경에서 H-E염색으로 변성된 신경세포로 보이는 신경세포가 모두 지연성 신경세포 손상으로 진행되지 않는 것을 알 수 있었다. 따라서 면역염색이나 생화학적 방법으로 효소나 단백질의 변화를 보거나 전자현미경에서 미세구조의 변화를 본다면 이들 세포간에 차이가 있을 것으로 생각한다. 비록 제3군에는 해마의 subiculum-CAI과 CA2-3의 신경세포가 비슷한 변화를 보였지만 제4군에서 CA2-3의 신경세포만 1일과 3일에 현저한 보호효과를 보인 것은 해마의 신경세포가 부위에 따라 다른 특성을 갖는 것과 합당한 소견으로 생각한다. 이와 같은 nNOS 억제에를 투여하는 시간에 따라 신경세포의 보호효과가 다른 것으로 보아 뇌졸중 환자의 치료에 이런 약제를 사용하게 되는 경우에 투여시간이 매우 중요한 요소로 작용하게 될 것을 알 수 있다. 또한 본 실험에서 매개체를 투여한 대조군과 실험군에서 국소 경색이 발생한 것은 치료에 따른 부작용의 하나로 국소경색이 발생한 가능성을 시사한다. ; Since nitric oxide (NO) causes relaxation of vascular smooth music, inhibition of platelet aggregation, and activation of NMDA receptor, it is associated with pathogenesis of ischemia lesion. The relationship between cerebral ischemia and NO has been controversial and it is suggested that the effects of NO defend on the stage of evolution of ischemic process as well as types of NO. The present study was designed to investigate the effect of neuronally derived NO (nNO) on development of delayed neuronal damage of hippocampus in gerbils. 7-nitroindazole (7-NI) was used as selective inhibitor of neuronal NO synthase (nNOS). The transient global ischemia was induced by bilateral common carotid arteries (CCA) occlusion for 10 minutes followed by 1 or 3day reperfusion. All gerbils were thermoregulated for the entire duration of anesthesia. Gerbils were randomly divided into four groups: Group 1, ischemic control (n=6); Group 2, vehicle (n=6); Group 3, 7-NI (25 mg/kg) given intraperitoneally just after CCA cramping (n=11); and Group 4, 7-NI given 40 minutes after CCA cramping (n=10). Each group was divided into two subgroups (1 or 3 day reperfusion). The ishemic neuronal damage was evaluated in subiculum-CAI areas of hippocampus. The results showed typical delayed neuronal damage in hippocampus of Groups 1 & 2, Group 3 showed similar changes of neurons in subiculum-CAI &CA2 with Groups 1 & 2 at 1 day, compared with significantly less damage of neurons at 3 days. Group 4 showed similar changes of neurons in subiculum-CAI compared with Group 1 & 2 at 1 & 3 days. In contrast, neurons in CA2 showed significantly less change at 3 days. At 3 days, subiculum-CAI of Group 3 showed significantly less neuronal damage compared with Group 4. One out of 6 vehicle treated gerbils of Group 2 as well as 5 out of 21 7-NI & vehicle treated gerbils (Group3 & 4) showed localized ischemic infarcts in addition to delayed neuronal damage. The results indicated that 7-NI had neuroprotective effect in delayed neuronal damage in subiculum-CA1 and CA2 in gerbils with transient global ischemia, which confirmed the role of nNOS. The difference between Groups 3 & 4 suggested the important of 7-NI injection time to prevent neuronal damages in delayed neuronal death as well as different characteristics of neurons according to the areas of hippocampus. Significantly less damages of neurons of Group 3 at 3 days compared with similar changes of neurons at 1 day suggest that not all the damaged neurons seen on H-E stain at 1 day of reperfusion progressed to neuronal death at 3 days. Since this study only showed the changes up to 3days, further study with longer duration of reperfusion will be necessary to see the later changes. Occurrence of ischemic infarction in vehicle treated gerbils suggested the importance of solubility of vehicle. In conclusion, the earliest possible injection of nNOS inhibitor into patients with transient global ischemia would be helpful for prevention of progressive neuronal damages.