자궁경부 암화 과정에서의 E-Cadherin발현에 관한 연구

Abstract

전이하는 암세포는 세포간 유착(intercellular adhesion)이 소실되어 침윤성이 증가하고 기저막(Basement membrane)을 침윤하거나 세포외 기질과 반응을 일으킨다. 두 경부 상피암이나 침윤성 피부기저암에서의 세포간 유착소실에 E-Cadherin이 관여되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 연구는 첫째, 자궁경부암에서의 암화과정 중 세포간 유착소실에 E-Cadherin이 관여하는지를 알아보고 자궁경부암의 침윤성에 밀접한 관련성이 있는지 규명하고자 했으며 둘째, 혈청내 용해성 E-Cadherin이 자궁경부암을 진단하거나 예후를 예측하는 지표가 될 수 있는지와 셋째 자궁경부암에서 침윤성에 E-Cadherin과 같은 상피세포의 유착물질(adhesion molecole)의 소실이외에 기저막 성분변화의 역할에 대하여 연구하고자 하였다. 연구재료는 1995년 6월부터 1995년 12월까지 이화여자대학교 동대문병원 산부인과나 원자력병원 산부인과를 내원한 환자 중 정상 자궁경부 조직을 가진 환자16명과 중등도 이형성(moderate dysplasia)환자 4명, 고도 이형성(severe dysplasia)환자 10명, 상피내암(carcinoma in situ)환자 8명, 각화성 자궁경부암(keratinizing cervical carcinoma)환자 5명, 비각화성 자궁경부암(nonkeratinizing cervical carcinoma)환자 8명을 대상으로 각각의 혈청과 파라핀포매조직(paraffin block)으로 연구하였으며 자궁경부암 세포주는 C-33A, SiHa, CaSki, HeLa 세포주로 연구하였다. 연구방법으로는 혈청 E-Cadherin은 효소면역측정(enzyme immunoassay)에 의하여 측정하였고 파라핀포매조직의 E-Cadherin 발현정도는 면역조직화학염색에 의해 비교관찰하였다. 자궁경부암 세포주를 배양, Western Blotting을 시행하여 E-Cadherin 발현정도와 β-Catenin 발현정도를 관찰하였으며 E-Cadherin 발현이 뚜렷한 CaSki 세포주에서 E-Cadherin, α-Catenin, β-Catenin, γ-Catenin 결합정도를 관찰하였으며 자궁경부암 세포주의 raft 배양후 만든 파라핀포매조직에서 E-Cadherin 면역세포화학염색을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 혈청 E-Cadherin의 평균치는 각 군간에 통계적인 유의한 차이는 없었다. 2. 면역조직화학염색에 의한 E-Cadherin의 발현은 자궁경부 전암단계의 정도가 진행될수록, 암의 분화도가 좋지 않을수록 낮은 것으로 나타났다(p<0.05). 3. E-Catenin이 발현되는 조직층은 전암단계의 정도가 진행될수록 기저층(basal layer)이나 기저상층(suprabasal layer)이외에 전층이나 표면층으로 나타났다(p<0.05). 4. 정상자궁경부 조직에서는 E-Cadherin이 세포질내에도 강하게(+++) 발현됐으나 전암단계가 진행될수록, 암의 분화도가 좋지 않을수록 세포질내의 E-Cadherin은 발현되지 않았다. 막성 E-Cadherin이 강하게 발현된 경우만이 세포질내의 E-Cadherin도 발현되는 것으로 나타났다(p<0.05). 5. 자궁경부암 세포주 배양에서 C-33A세포주와 HeLa 세포주는 서로 접촉하지 않고 흩어져서 자라는 양상으로 보였으며 CaSki세포주와 SiHa세포주는 세포끼리 접촉하며 자라는 양상을 보였다. 6. 배양된 4종류 세포주의 E-Cadherin westing blotting에서 CaSki세포주와 SiHa세포주에서는 120Kda E-Cadherin band가 관찰되었고 C-33A세포주와 HeLa 세포주에서는 E-Cadherin band가 관찰되지 않았다. 이같이 세포주가 자라는 양상과 E-Cadherin band유무가 일치하였다. 7. E-Cadherin band가 관찰된 CaSki세포주와 SiHa세포주에서의 β-Catenin Western Blotting에서 동일한 수준의 88KDa β-Catenin band가 관찰되었다. 8. CaSki 세포주의 E-Cadherin면역침전에서 120 KDa E-Cadherin band가 관찰되었고 102 KDa α-Catenin band, 88KDa β-Catenin band, 80KDa γ-Catenin band들이E-Cadherin과 결합하여 공동침전되었다. 9. 4종류의 자궁경부암 세포주를 raft배양한 결과 CaSki 세포주는 자라지 못하였다. 기저막 성분을 주지않은 표준 C-33A세포주와 기저막 성분 중 laminin을 준 SiHa세포주의 경우만이 기질내로 침윤하며 자라는 양상을 보였다. 10. raft배양된 세포주를 파라핀포매조직으로 만든 후 시행한 E-Cadherin 면역세포화학염색에서 이상의 3종류 세포주가 모두 음성(-)반응을 나타내었다. 이상의 결과에 의하여 E-Cadherin은 자궁경부 암화과정에 관여하며 특히, 침윤암의 분화도와 자궁경부 전암단계의 정도와 밀접한 관련이 있으므로 조직내에서 E-Cadherin을 검사하는 것은 암 진행의 진단적 가치가 있다. 그러나 혈청 E-Cadherin을 측정하여 자궁경부암의 진단과 예후를 판단하는데 사용하는 것은 앞으로 계속적인 연구에 의하여 의미가 밝혀져야하며 자궁경부의 침윤성에는 E-Cadherin이외에도 기저막 성분이나 다른 인자가 관여할 것으로 사료되므로 계속적인 연구가 필요하다고 하겠다. ; E-Cadherin is the prime mediator of cell-cell adhesion in epithelial cells and its loss may be important in tumor spread. The present study was aimed to find the role of E-Cadherin in cervical carcinogenesis, to assess the clinical value of serum soluble E-Cadherinin diagnosing or monitoring the progression of cervical cancer, and to find the role of other factor than E-Cadherin in the invasiveness of cervical cancer. The subject of this study included the serums and paraffin blocks of cervix in women with the normal cervix(16 cases), and patients with moderate dyspladia(4 cases), severe dysplasia, CIS(8 cases), keratinizing cervical carcinoma(5 cases) and nonkeratinizing cervical carcinoma(8 cases). For in vitro assay, cervical cancer cell lines, e.g. C-33A, CaSki, SiHa and HeL cell lines were used. The serum levels of E-Cadherinin in women were measured by enzyme immunoassay. Every paraffin block of cervix was stained for E-Cadherinin by immunohistochemical staining. After culture of 4 cervical cancer cell lines, western blotting an immunoprecipitation were performed to detect E-Cadherinin and catenin bands. Finally immunocytochemical staining for E-Cadherinin was tried by raft cultured cell lines. The results were as follows; 1. there was no differences in the serum levels of E-Cadherinin among the women who had the normal cervix, patients with moderate dysplasia, patients with severe dysplasia, patients with CIS of cervix, and patients with keratinizing cervical carcinoma and nonkeratinizing cervical carcinoma. 2. Los of E-Cadherinin expression was closey related with the grade of dysplasia of cervix and the differentiation of cervical cancer(p<0.05). 3. E-Cadherinin was strongly expressed in the basal layer and suprabasal layer of the normal cervix, but its expression was shown in the other tissue layers of dysplasia of cervix(p<0.05). 4. the cytoplasma E-Cadherinin expression was related to membranous expression and it was correlated with the grade of dysplasia of cervix and the differentiation of cervical cancer(p<0.001). 5. while C-33A, and HeLa cell lines showed fibroblastoid growth, CaSki, and SiHa cell lines showed epithelial contact growth. 6. by western blotting, there were visible 120 kDa E-Cadherinin band in CaSki, and SiHa cell lines. The morphology of epithelial growth was related with the presence of E-Cadherinin in cervical cancer. 7. In CaSki, and SiHa cell line, 88 KDa β-Catenin bands were shown by western blotting. 8. by immunoprecipitation for E-Cadherin of CaSki cell line, 120 kDa E-Cadherinin band was detected and associated with 102 KDa α-Catenin band, 88KDa β-Catenin band, 80KDa γ-Catenin polypeptides. And Most E-Cadherin was readily extractable in NP_40 extraction buffer. 9. in raft culture of 4 cevical cancer cell lines, all cancer cell lines except CaSki cell line were well grown at the air-liquid interface. C-33A cell line was able to invade the type I collage matrix without basement membrane supplementation and SiHa cell line also invaded into collagen only after the supplementation of laminin on type I collagen matrix. 10. there was negative E-Cadherin expression in raft cultured cell lines. In conclusion, it is considered that first, E-Cadherin has a role on cervical carcinogenesis, its loss is related with the grade of dysplasia of cervix and the differentiation of cervical cancer. However measuring soluble E-Cadherin level may not reflect the progression of cervical cancer accurately. Factors other than E-Cadherin, e.g. basement membrane component, may have a role in the invasiveness of cervical cancer.