High throughput analysis of gene expression patterns in Arabidopsis under cold stress using SAGE and microarray techniques

Abstract

많은 식물체는 결빙온도가 아닌 저온에 노출되었을 때 저온순화(cold acclimation) 라는 과정을 통하여 적응능력을 증가시킨다. 이 과정에서 동반되는 많은 생리, 생화학적인 변화는 유전자 발현에의 조절을 통하여 이루어 진다. 그러나 식물의 발달단계에 따라 저온에 대한 민감성이 다르게 나타나며, 특히 꽃가루세포의 성숙기간은 저온민감성 식물에서 가장 저온에 민감한 단계로 알려져 있다. 본 연구에서는 애기장대의 꽃가루세포를 재료로 하여 저온에 의한 꽃가루세포의 유전자 발현양상을 파악하고 저온민감성에 대한 분자생물학적 해석을 도모하기 위하여 SAGE 방법을 적용하였다. 정상조건에서 취한 꽃가루 세포와 저온 처리한 꽃가루세포에서 SAGE library를 작성한 결과 각각 21,237개와 22,216개의 SAGE tag을 확보하였다. 꽃가루세포의 transcript profile은 pollen의 생식기관으로서의 특성을 잘 보여준다. 꽃가루세포에서 발현되는 유전자를 기능별로 분류해보면 polygalacturonase, pectate lyase, pectin methyesterase와 같이 세포막 생합성에 관련된 유전자들을 비롯한 세포 소기관 형성에 관여하는 유전자들이 전체 전사체의 40% 이상을 차지한다. 이에 반해, 잎에서 많은 부분을 차지하고 있는 에너지나 단백질 합성과 관련된 유전자들은 pollen에서 상대적으로 그 발현 정도가 적다. 한편, 저온 처리한 꽃가루세포에서는 저온이라는 자극에 의해서 일부 유전자들의 발현정도가 변할 뿐, COR, lipid transfer protein, β-amylase와 같이 저온순화에 필요하다고 알려진 많은 유전자들은 크게 유도되지 않고 발현정도가 그대로 유지되거나 약하게 유도된다. 이러한 유전자의 결함은 저온에 의한 꽃가루세포의 기능장애와 연관되어 있을 가능성이 높다. 이러한 꽃가루세포에서의 유전자 발현정보와 더불어 SAGE와 SSH법을 적용하여 얻어낸 애기장대 잎의 유전자 발현정보를 이용하여 저온 스트레스 연구를 위한 cDNA microarray를 제작하였다. 이 microarray는 SAGE tag으로부터 기인한 600여 개의 GLGI products와 SSH clone으로부터 확보한 69개의 PCR products를 포함한 712개의 cDNA probe로 구성되었다. 제작된 microarray는 네 번의 반복 실험에 대한 상관관계 분석과 SAGE data와의 비교분석을 통하여 그 유용성을 입증하였다. 저온처리 시간에 따른 유전자 발현 패턴을 분석하기 위한 실험을 수행한 결과, 대부분의 유전자가 후반부, 즉 8시간 저온처리 후에 큰 변화를 보였다. 이 중 264개의 저온 유도성 유전자와 33개의 저온 억제성 유전자를 선별하여 그 발현패턴에 따라 10 type으로 분류하였다. 여기에는 기존에 알려진 유전자들 이외에 새롭게 저온 관련 유전자로 밝혀진 것들이 많이 포함되어있다. 이 중 유도의 정도가 큰 30개의 유전자들의 promoter부위 염기서열을 분석한 결과 21개의 유전자에서 ABRE또는 DRE-like element를 확인할 수 있었다. 이들은 cis-element 조성에 따라 4 그룹으로 나누어 볼 수 있는데, ABRE와 DRE-like element 두 가지 모두 가지고 있는 첫번째 그룹은 8가지의 유전자가 해당되며 이 중 3가지는 아직까지 저온관련 유전자로 알려지지 않은 새로운 유전자이다. 이 첫번째 그룹 유전자들은 아마도 CBF에 의해 매개되는 ABA-independent pathway와 bZIP에 의해 매개되는 ABA-dependent pathway의 조절을 모두 받는 유전자로 보인다. 두 번째 그룹에 속하는 13가지의 유전자는 ABRE나 DRE-like element 중 하나만 가지고 있으며 이 중 10가지가 새로운 유전자이다. 나머지 9가지 유전자는 모두 새로운 유전자로서 ABRE, DRE-like 둘 다 가지고 있지 않는 그룹에 속한다. 이러한 사실은 지금까지 잘 알려져 있는 이 두 pathway이외에 다른 signal pathway가 존재하여 저온 관련 유전자의 발현조절에 관여할 것이라는 가설을 뒷받침한다. 본 연구에 사용된 cDNA microarray는 식물의 스트레스 반응에 관한 연구에 유용한 도구로 사용될 수 있으며 본 연구의 결과는 식물의 저온순화과정을 이해하는데 귀중한 자료가 될 것이다. ; Many plants increase freezing tolerance in response to low, nonfreezing temperature through a phenomenon known as cold acclimation. This adaptive process involves several biochemical and physiological changes that seem to be regulated through changes in gene expression. However, the sensitivity to cold temperature differs in each stages of plant development and the maturation of pollen is known to be the most sensitive to chilling temperature during the entire life cycle of chilling-sensitive plants. As a first step towards understanding the molecular background to explain the responses to cold temperature in Arabidopsis pollen, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) method was applied and obtained 21,237 and 22,216 SAGE tags from normal and cold-treated pollen SAGE libraries, respectively. Transcript profiles in normal pollen represent well the characteristics of pollen as a reproductive organ. According to the functional classification of the genes expressed in pollen, the genes involved in cellular biogenesis such as polygalacturonase, pectate lyase and pectin methyesterase were more than 40% of total transcripts. However, the genes involved in energy and protein synthesis, which categories are prevalent in leaves, were relatively expressed at low level. On the other hand, in cold-treated pollen at 0℃ for 72 hr, where the rate of pollen tube growth was reduced to 60% and seed production was greatly reduced, although the expression level of some genes was altered by cold stimulus, many genes thought to be responsible for cold acclimation such as COR, lipid transfer protein and β-amylase were not highly induced but maintained or weakly induced. This genetic defect correlate with the physiological effects on pollen function. Next, on the basis of previous observations from SAGE and SSH results in Arabidopsis leaf and pollen, a specialized cDNA microarray comprising 712 cDNAs was constructed for cold-stress research. In this microarray, ~600 GLGI products from SAGE and 69 PCR products from SSH clones were included. All elements were spotted in duplicate. The validity of microarry was demonstrated by comparing of the four replicate slides (correlation coefficient 0.8) and by comparing the results with the SAGE gene expression data (correlation coefficient 0.4). Using this microarray, time course experiments were conducted to monitor the changes in the gene expression patterns. Because the probes spotted on array were selected among the genes differentially regulated by 72 hr cold treatment, the majority have tendency to change strongly after 8 hr cold treatment. In total, 264 up-regulated and 33 down-regulated genes were selected and subdivided into 10 types according to the their transcription patterns. Many novel genes not previously known to be cold-regulated as well as well-known cold inducible genes were identified. Concentrating a detailed analysis on the 30 genes highly induced in late phase revealed that 21 genes contain ABRE and/or DRE-like element, which are two important cis-elements have been reported in the promoter regions of many cold-inducible genes. They can be grouped by four according to the components of their promoter regions. As a first group, 8 genes including 3 novel genes have both ABRE and DRE-like elements. It suggests that both bZIP-mediated ABA-dependent and CBF-mediated ABA-independent pathways might control expression of these genes. Thirteen genes were belonged to second or third group that have only ABRE or DRE-like element. Among them, 10 were novel genes. The remaining 9 novel genes have not any ABRE or DRE-like element in the promoter region. This fact supports the hypothesis that besides these two signal pathways, the other signal pathways might exist and involve in expression of cold inducible gene. cDNA microarray used in this study may be a useful tool for studying in plant stress responses and the results presented here will provide valuable information toward understanding the mechanisms of the cold acclimation in plants.