Functional Studies on Small Ubiquitin Related Modifier, SUMO-1, in Stress Response

Abstract

Small Ubiquitin-like modifier (SUMO) 단백질은 101개 아미노산으로 구성된 ubiquitin 유사 단백질(ubiquitin-like protein)로서, ubiquitin과는 아미노산 서열이 18% 동일하고, 48%의 유사성 있는 구조를 가지고 있다. SUMO-1은 post-translational modification을 일으키는 단백질 중의 하나로 표적 단백질의 기능, 활성, 세포내의 위치 등의 변화를 주도하는 중요 수단이 된다. 하지만, SUMO-1 단백질이 ubiquitin과 구조상으로 흡사하나, 그 생물학적 기능은 ubiquitin과 상이하다. 그러나 아직까지도 SUMO-1의 생체 내 기능에 대해서는 많은 부분이 알려져 있지 않기 때문에 앞으로 이에 대한 연구가 많이 진행되리라 예상된다. Ubiquitination은 cytokine treatment, hypoxia, heat shock과 같은 세포 stress에 의해 accumulation되고 proteasome에서 표적 단백질의 degradation을 유도한다. 즉, cellular stress에 의해 유도된 polyubiquitination된 단백질이 세포 내에 accumulation됨으로 세포 사멸을 야기한다. 본 연구에서는 크게 세 가지 부분의 SUMO-1에 대한 연구를 진행하였다. 첫째로, 외부에서 stress가 주어졌을 경우 SUMO-1이 세포 내에서 어떠한 기능을 하는지 알아보고자 하였다. 이를 위하여, SUMO-1이 과발현된 세포를 준비하고, stress(heat shock) 를 준 후, immunoprecipitation과 western blotting을 통하여 sumoylation의 변화를 알아보았다. 이 결과, heat shock을 준 경우, SUMO-1에 의해 modify된 단백질이 의미있게 증가함을 관찰 할 수 있었고, 이러한 현상이 세포에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 SAPK/JNK assay와 MTT assay를 실시한 결과 SUMO-1을 과발현 시킨 세포의 경우 thermotolerant해짐을 알 수 있었다. 뿐만 아니라 이러한 현상의 분자적 기전을 알아보기 위해서 ROS를 측정해 본 결과 heat shock 또는 PDGF stimulus에 의해 생성되는 ROS가 SUMO-1에 의해 block되는 결과를 보여, ROS생성에 SUMO-1이 관여함을 보였다. 또한, heat shock을 주고 SUMO-1의 localization을 조사한 결과 heat shock에 의해 SUMO-1 및 SUMO-1 modified proteins의 세포내 분포가 변화함을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 현상의 정확한 작용기전을 확인하기 위해서 세포내 ROS 생성 분자인 NAD(P)H oxidase complex에 대한 연구를 진행하였고, SUMO-1이 NAD(P)H oxidase의 activity를 저해하여 세포내 ROS 생성을 감소시킴을 알수 있었다. 둘째로, SUMO-1에 의해 modify되는 단백질의 sumoylation site을 찾기 위해서 proteomics를 이용하였다. 지금까지의 연구는 target 단백질의 sumoylation site을 밝혀내기 위해 많은 노력을 하였으나, target 단백질의 fragment 중 sumoylation site의 질량이 급격히 증가하여 질량 분석기의 기술적인 한계에 의해서 연구에 어려움을 겪어왔다. 이에 point mutation된 SUMO-1 protein(SUMO T95K)을 제조하고, 이 단백질이 정상 SUMO-1과 동일한 sumoylation 활성을 가지며, 이를 이용하여 sumoylation site 분석이 가능함을 확인하였다. SUMO-1 단백질의 mutant를 이용하여 sumoylation site을 밝힌 단백질을 확인 함으로써, 앞으로 이런 방법으로 찾은 단백질들과 SUMO-1과의 상관성에 대한 연구가 계속 진행될 예정이다. 마지막으로, 본 실험실에서 연구해온, hFAF1 단백질에 대한 SUMO-1의 작용에 대하여 연구하였다. 특히, SUMO-1단백질의 ubiquitin proteasome pathway에 대한 SUMO-1의 역할을 규명하고자 hFAF1단백질의 여러 truncation중에서 UBA domain을 지니는 fragment에 대한 SUMO-1의 effect에 대하여 알아보았다. hFAF1단백질의 한 domain인 UBA domain은 hFAF1의 N terminus에 존재하고 multiubiquitination된 단백질을 recruit한다. 이러한 발견은 hFAF1이 polyubiquitination된 단백질의 ubiquitin proteasome pathway에 의한degradation을 억제하고, post ubiquitination step 의 rogulator로서 역할을 의미한다. In vitro와 In vivo study에서 SUMO-1 이 hFAF1의 UBA domain 역할인 polyubiquitination된 단백질을 recruit하는 작용을 억제함을 확인할 수 있었다. 앞으로 이 결과를 바탕으로 SUMO-1의 regulating mechanism을 연구할 예정이다.;Small ubiquitin-like modifier (SUMO) is a member of the superfamily of ubiquitin-like polypeptides that become covalently attached to various intracellular target proteins as a way to alter their function, cellular localization, and/or half-life. Even though SUMO is the structurally related to ubiquitin molecule for protein degradation, its biological functions are distinct to ubiquitin, yet poorly understood regulatory signal. Protein ubiquitinations accumulated by various signals including cytokine treatments and cellular stresses (hypoxia and heat shock etc.) induce protein degradation in proteasome. Simultaneously, cellular accumulations of polyubiquitinated proteins by cellular stresses can induce the cell death. In this study, I examined whether protein sumoylation counteracts to the protein ubiquitination, and found that the overexpression of SUMO protects the cell death induced by various stresses including heat shock and growth factors. To explain the effect of SUMO in stress response, the generation of reactive oxygen species (ROS) induced by various stresses was investigated. The overexpression of SUMO-1 significantly inhibited the generation of ROS, which caused from inhibition of NADPH oxidation by SUMO-1. SUMO was overexpressed in response to stresses and sumoylation reduced ROS generation induced by various stresses. This suggests that sumoylation has another regulation system in response to various stresses even with similar molecular structure as ubiquitination. To investigate the role of SUMO-1 on ubiquitin-proteosome pathway, the effects of SUMO-1 on UBA domain of hFAF1 was examined. hFAF1 was known to have UBA domain recruiting and accumulation multiubiquitinated substrates in the N-terminus. These findings show that hFAF1 is involved in the ubiquitin-proteasome pathway by inhibiting the degradation of polyubiquitinated proteins and functioning as a regulator in the post-ubiquitination step. In vitro and in vivo study showed that SUMO-1 inhibits the recruiting of multiubiquitinted substrates to the UBA domain of hFAF1. The detailed regulatory mechanism of SUMO should be further studied. The results suggest that SUMO-1 can act on survival signals by inhibiting the ROS generation in stress response and by blocking the function of UBA domain in hFAF1.