단세포성 항체를 이용한 acetylcholinesterase의 구조 연구

Abstract

본 연구에서는 acetylcholinesterase(AChE)의 분자 구조를 연구하기 위하여 한국산 및 캘리포니아산 전기 가오리의 전기 조직과 사람 태반에서의 AChE를 dicaproylmethylpyridinium을 ligand로 사용한 affinity column chromatography에 의해 정제하여 생화학적 구조를 조사하였다. 한국산 전기 가오리의 전기 조직 82.47g에서 정제된 총 AChE 효소 단백질은 7.84mg이었고 효소 고유의 활성은 고염 용출성 AChE는 52.2배, detergent 용출성 AChE는 38.89배씩 정제 후 증가되었다. 정제된 AChE를 전기 영동한 결과, 고염 용출성 AChE의 활성 부위 단백질은 한국 전기 가오리가 64Kd, 캘리포니아산 전기 가오리가 67Kd로 나타났고, detergent 용출성 AChE는 한국 전기 가오리가 60Kd, 캘리포니아산 전기 가오리가 62Kd로, collagen tail의 경우 한국 전기 가오리가 58Kd, 캘리포니아산 전기 가오리가 50Kd로 각각 다르게 나타났으며 103Kd 단백질은 동일한 위치에 나타났다. 이들 AchE 구성 단백질들을 단세포성 항체를 사용하여 Western blot 방법으로 동정하였다. 각 구성 단위 중 효소 활성 중심 부위를 인식하는 단세포성 항체인 mAEH-CA에 의해서 캘리포니아 전기 가오리의 고염 용출성 및 detergent 용출성 AChE의 활성 부위는 확인되었으나, 한국 전기 가오리의 활성 부위는 확인하지 못하였고, collagenic tail과 103Kd 단백질은 한국산 및 캘리포니아산 전기 가오리 모두에서 확인되었다. 이로부터 한국산과 캘리포니아산 전기 가오리의 효소 활성 부위의 구조적 차이점이 있을 것으로 사료되어 elastase, Streptomyces griceus protease 및 papain으로 부분적 단백질 분해를 하여 조사한 결과 한국산과 캘리포니아산 전기 가오리에서 각각 고유한 단백질 단편들이 단세포성 항체에 의하여 확인되었다. 또한 사람 태반 AChE는 단세포성 항체를 사용하여 동정한 결과 65Kd의 활성 단위를 갖는 detergent 용출성 AChE가 확인되었고, 이의 서당 침강 계수는 5.21S인 것으로 나타나 사람 태반에 존재하는 AChE는 G_2형인 것으로 조사되었다. ; To study the molecular structure of acetylcholinesterase(AChE), AChE of the electric organ of Korean electric-ray(Narke japonica), Torpedo californica (TC) and human placenta have been purified by affinity column chromatography with dicaproyl-methylpyridinium. The yield of purified AChE from 82.47g of Korean electric ray sample was about 7.84mg. After purification, the specific activities were increased by 52.2 and 38.89 times for high salt soluble AChE and detergent soluble AChE, respectively. In the separation into each subunit by SDS polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE), catalytic subunit of high salt soluble AChE appeared as 64Kd in Narke japonica and 67Kd in Torpedo californica. Catalytic subunit of detergent soluble AChE appeared as 60Kd in Narke japonica and 62Kd in Torpedo californica. Collagen tail was 58Kd in Narke japonica and 50Kd in Torpedo californica. 103Kd had almost same mobilities. These subunits of AChE were transferred into immobilon P by Western blot and identified each band using monoclonal antobodies(mAbs) against Torpedo californica AChE subunits. While collagenic tails and 103Kd from Korean and Californian electric ray were detected by common mAbs, catalytic subunits of high salt soluble AChE and detergent soluble AChE from Narke japonica were not detected by the active site specific mAb(mAEH-CA) against catalytic subunit of AChE from Torpedo californica. Therefore, the differences between the two catalytic subunits from Korean and Californian electric ray were investigated by the partial proteolytic digestion with Str eptomyces griceus protease, papain and elastase. Catalytic site specific mAbs(mAEH-CP and mAEH-CA) detected the unique proteolytic products in two kinds of AChEs. On the other hand, the existence and molecular forms of AChE from human placenta were examined. The molecular weight of placental detergent soluble AChE appeared as 65Kd in SDS-PAGE and was detected as one band by catalytic site specific mAbs. The sedimentation coefficient of placental detergent soluble AChE in sucrose density gradients was determined as 5.21S.