Functional studies of culture-derived megakaryocytes and platelets from K562 cells by (R)-NALPCE

Abstract

최근 과학기술의 진보와 더불어 현대 의학이 눈부시게 발달되었음에도 불구하고 현대인의 다양한 생활환경과 식생활의 변화 및 노령화 등 여러 가지 요인으로 인하여 새로운 난치병과 성인병이 꾸준히 증가하는 추세이다. 혈액과 관련된 암의 치료 목적으로 사용되는 화학요법 및 방사선 치료요법 등은 혈액관련 암세포뿐만 아니라 일반 정성골수세포, 특히 조혈, 면역기능을 조절하는 조혈세포도 아울러 손상시켜 인체 내의 조혈기능과 면역기능을 마비시키는 것이 심각한 문제점으로 지적되어 오고 있다. 이러한 심각한 골수세포의 손상으로 인한 백혈구나 혈소판의 감소는 면역기능의 마비로 이어진다. 따라서, 백혈병, 재생불량성 빈혈, 선천성 간헐적 백혈구 감소증, 선천성 면역조혈모세포 결여증, 악성혈액질환 등 혈액 관련 암 질환에서 조혈 모세포원을 촉진 성장시켜 저하된 혈액세포의 조혈 면역기능을 향상시킬 수 있는 신물질 개발은 매우 중요하다. 거핵구는 혈소판을 생산하는데 있어서 필수적인 기능을 제공하는데, 거핵구생성작용이란 순환하는 혈소판을 분비하기 바로 전단계까지의 과정을 말한다. 거핵구생성작용은 복합적인 세포과정으로서 조혈줄기세포로부터 분화가 시작되는데, 핵유사분열과 거핵구분화를 통한 전구세포의 복제 및 성숙과정으로 이루어진다. 본 연구는 (R)-NALPCE 에 의해서 K562 (만성골수성암세포주) 세포로부터 유도된 거핵구 및 혈소판의 기능을 정상세포와 비교하여 연구하는 것이다. K562 세포는 인간만성골수백혈병 세포주로서 혈액 줄기세포, 즉 골수성 줄기세포로 분화가능한 전구세포를 의미한다. 이 세포주는 단핵백혈구, 호중구, 호산성구, 적혈구, 대식세포, 거핵구, 혈소판으로 분화가 가능한 세포이다. K562 세포에 (R)-NALPCE를 처리하였을 때, 거핵구 분화시 특이적으로 발현되는 단백질인 CD 41 (당단백질 IIb) 과 호중구 분화시 발현되는 CD 16이 특이적으로 발현되었으며, 적혈구 인지 단백질과 단핵백혈구 인지 단백질은 발현되지 않았다. PMA와 같은 물질은 다양한 계통으로 조혈 줄기세포로 분화시키는 반면, (R)-NALPCE는 더 특이적으로 거핵구 인지 단백질을 더 많이 발현시켰다. 거핵구로의 분화기능을 향상시키기 위해 기조직 세포인 OP9 세포를 이용하였다. OP9 기조직 세포는 macrophage-colony stimulating factor와 colony stimulating factor-1가 없는 세포로서 stem cell factor와 IL-6와 같은 조혈세포로 분화 인자를 발현시킨다. (R)-NALPCE를 처리한 K562 세포와 OP9 세포를 동시배양한 경우 거핵구로의 분화가 증진되었으며, 혈소판과 유사한 세포들을 관찰 할 수 있었다. 이 경우 CD 41 뿐만 아니라 CD 61 (당단백질 IIIa), CD 42b (당단백질 Ibα)와 같은 거핵구분화시 발현되는 단백질들이 15% 이상 발현되었다. 이와 같은 결과는 조혈 전구세포인 K562 세포가 거핵구로 분화되고 성숙되고 있음을 말해주는 결과이다. 일반적으로 거핵구가 성숙되면서 fibrinogen의 수용체인 당단백질 IIb-IIIa의 수가 증가하게 되는데, 이러한 수의 증가는 혈소판을 활성화시키는 물질인 thrombin, ADP, collagen, AYPGFK등에 의해서 거핵구는 활성화되어 ligand인 fibrinogen이 당단백질 IIb-IIIa에 결합한다. (R)-NALPCE 에의해 분화된 거핵구에 혈소판을 활성화시키는 물질을 처리한 후 결합된 fibrinogen의 수는 4일째 최대로 증대 되었다. 4일째 분화된 세포들을 크기별로 또한 CD 41을 발현하는 세포들 만을 모아서 fibrinogen 결합실험을 수행한 결과 75% 정도의 세포가 거핵구로 분화된 것을 확인 할 수 있었다. 거핵구 및 혈소판의 분자미세구조를 관찰하기 위해 투과형 전자현미경을 수행하였다. 분화 후 5일째, (R)-NALPCE에 의해 분화된 거핵구는 일반적으로 핵유사분열시 나타나는 현상으로서 많은 수의 핵과 dense granule을 관찰할 수 있었으며, 그 외에도 혈소판이 분리되는 부분인 경계채널이 분포되어 있었으며, 그것의 크기도 수십 마이크로미터 정도 였다. (R)-NALPCE에 의해 분리된 혈소판은 혈액에 존재하는 혈소판에서 나타나는 특징적인 구조물들, dense core granules, 미세소관 및 핵이 없는 상태를 관찰 할 수 있었다. 이러한 결과로서 K562 세포는 OP9 세포와 동시배양한 경우 (R)-NALPCE에 의해 핵유사분열과정으로 들어가서 거핵구로 분화되고 성숙되고 있음을 제시하고 있으며, 이렇게 분화된 거핵구는 정상 거핵구와 마찬가지로 당단백질 IIb-IIIa를 통해서 활성화 신호 (inside-out signaling)가 전해지는 것을 알 수 있다. (R)-NALPCE에 의해 유도되는 거핵구생성작용시 관여하는 유전자를 연구하기 위해서 oligonucleotide genechip array를 수행하였다. 분석된 유전자들 중, 34개의 유전자가 (R)-NALPCE에 의해 2배이상 뚜렷한 증가를 보였다. 34개의 유전자 중에서 PI3-Kinase 억제제인 LY294002를 전처리하여 증가하지 않은 유전자가 13개가 분석되었다. 이 유전자들은 주로 지질의 대사와 생합성에 관련되는 유전자 (SQLE, HMGCS 1, DHRS3, CA4), 면역반응에 관여하는 유전자 (EBI2, LCP2), cell to cell adhesion (ICAM1), actin cytoskeleton (ABLIM1, EPLIN), 세포신호전달 (EAT2, IL-8, SOCS3), translational initiation (MGC39820)들 이었다. 13개의 유전자 중에서 (R)-NALPCE에 의해 분화된 거핵구에서 IL-8의 발현을 시간별로 관찰하였다. IL-8 은 (R)-NALPCE 처리후 1시간 후부터 발현되기 시작하여 7시간에 발현이 최대가 되며, 그 후 수시간동안 IL-8의 발현이 유지되다가 감소하기 시작했다. LY294002를 1시간 전처리한 경우 IL-8 은 (R)-NALPCE을 처리하여도 발현되지 않았다. IL-8이 (R)-NALPCE 에 의한 거핵구 분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 IL-8 siRNA를 수행하였다. IL-8 siRNA는 IL-8 유전자의 발현을 억제시켰지만, 거핵구로의 분화는 약간 증가시켰다. 본 연구를 통해 IL-8 이 거핵구분화과정에서 발현되었고, 그 과정을 조절하는데 관여하는 유전자 임을 알 수 있었다.;Megakaryocytes, among the rarest of hematopoietic cells, serve the essential function of producing numerous platelets. Megakaryocytopoiesis is the cellular developmental process prior to the release of platelets into the circulation. The purpose of this study is to characterize differentiated megakaryocytes and platelets from K562 cells by (R)-NALPCE, and to investigate their biological functions, in particular, their megakaryocytic function. In this study, we investigated the characteristics of culture-derived megakaryocytes and platelets induced by (R)-NALPCE. Those cells expressed CD markers related to megakaryocytes and neutrophils. Megakaryocyte-specific cell surface markers like CD 61 were expressed almost 65% on day 4, and neutrophil-specific cell surface marker like CD 16 was expressed about 30%. In the study of expression of other myeloid lineage-specific markers, glycophorin A (erythrocyte marker) and CD 14 (monocyte marker), were not expressed by (R)-NALPCE in K562 cells. PMA has been broadly used in hematopoietic differentiation system, and K562 cells could express various lineage-specific markers such as megakaryocyte, neutrophil and monocyte by PMA. (R)-NALPCE could differentiate specifically K562 cells to megakaryocytes and neutrophils. To enhance the megakaryocyte differentiation and maturation by (R)-NALPCE, I used coculture system using OP9 stromal cells. CD 41 and CD 42b were expressed almost 60% ~ 80% on (R)-NALPCE-treated K562 cells when those cells cultured with OP9 stromal cells, and about platelets were released about 10%. To determine whether culture-derived megakaryocytes are capable of undergoing inside-out signaling, the specific binding of fibrinogen to αIIbβ3-positive cells was time-dependentally analyzed by treatment of agonist mixture, AYPGFK and ADP and epinephrine. Fibrinogen binding to activated αIIbβ3-positive cells was increased in a time-dependent manner. On day 4 most of differentiated cells became larger compared to control K562 cells and on day 5 proplatelet- and platelet-like cells were observed. On day 4, I sorted the CD 41 positive cells after treatment of (R)-NALPCE and the next day we conducted fibrinogen binding assay by agonist mixture. I collected about 30% of CD 41 positive cells, and fibrinogen binding percentage was increased compared to unsorted differentiated K562 cells. To confirm ultrastructures of culture-derived megakaryocytes and platelets we performed transmission electron microscopy. Culture-derived megakaryocytes were distributed demarcation channels, dense granules and lots of nuclei, and culture-derived platelets on 5th day had dense core granules, microtubules and anucleated blood cells. These results suggest that K562 cells performed endomitosis to differentiate megakaryocytes by (R)-NALPCE, and moreover K562 cells were participated in the process of thrombocytosis when it cocultured with OP9 stromal cells, and fibrinogen was bound to mgakaryocytes differentiated by (R)-NALPCE by a way of αIIbβ3 in response to agonist mixture, suggesting that they are normally undergoing inside-out signaling. To understand the genetic events of (R)-NALPCE during megakaryocytic differentiation, we carried out genechip analysis. From data analysis, a total 104 genes were up-regulated more than 2-fold by (R)-NALPCE treatment and 34 genes were assigned to an appropriate category according to its main cellular function. Among these genes, I got 13 genes increased by (R)-NALPCE and decreased (or closed to control level) by pretreatment of LY294002 (PI3K inhibitor) before (R)-NALPCE stimulation. These genes include lipid and nitrogen metabolism and biosynthesis (SQLE, HMGCS1, DHRS3, CA4), immune response (EBI2, LCP2), cell to cell adhesion (ICAM1), actin cytoskeleton (ABLIM1, EPLIN), signal transduction (EAT2, IL8, SOCS3), translational initiation (MGC39820). To elucidate the role of one of those genes, IL-8, in (R)-NALPCE-induced megakaryocyte differentiation, I analyzed its expression level in a time-dependent manner. Expression of RNA for IL-8 was induced within 1 hr after (R)-NALPCE stimulation, reached the peak level at 7 hr and sustained for a few hrs, and then declined thereafter. When PI3K inhibitor was pretreated before (R)-NALPCE stimulation, IL-8 gene did not express. To investigate the functional role of IL-8 in regulating megakaryocyte differentiation, K562 cells were transfected with siIL-8. When K562 cells were transfected with siIL-8, these cells increased the expression level for CD 42b, CD 61 and CD 41 by (R)-NALPCE, whereas CD16 was not changed. In a coculture system with OP9 stromal cells, similar results were obtained. IL-8 is reported to exert an inhibitory effect on hematopoiesis and especially on megakaryocyte proliferation and differentiation. Therefore the expression of IL-8 gene could negatively regulate the megakaryocytic differentiation. In summary, the expression of IL-8 gene in (R)-NALPCE-treated K562 cells regulated the megakaryocyte differentiation, not neutrophil differentiation, suggesting that the inhibition of IL-8 gene leads to enhancement of megakaryocytic differentiation.