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dc.description.abstractSyndecan-2 is a member of transmembrane heparan sulfate proteoglycan family in vertebrates and participates in diverse biological processes. In fact, syndecan-2 is mainly expressed in mesenchymal cells and various cells in migratory condition. However, the specific function of syndecan-2 at the cancer cell surface is still unclear. Thus, I examined the roles and regulatory mechanisms of syndecan-2 in high motile colorectal cancer and fibrosarcoma cells and found that syndecan-2 is a multi-functional adhesion receptor to regulate tumorigenic activity of cancer cells. Since syndecan-2 might be involved in the regulation of various points during carcinogenesis, its functions were investigated in two different sets of colon cancer cells. To determine syndecan-2 function at the early stage of colon cancer, syndecan-2 was overexpressed in a low metastatic HT-29 cells. Overexpression of syndecan-2 in HT-29 cells induced distinct morphological changes of which piled up in layers without clear boundary and significantly increased tumorigenic activity based on elevated cell migration/invasion, anchorage-independent growth, and proliferation. Consistently, transplantation of HT-29 cells with high expression of syndecan-2 into nude mice showed increased tumor mass, and in tissue microarray and immonohistochemistry of colon cancer patient tissue showed that syndecan-2 was upregulated at early stage in colorectal carcinogenesis. Besides, MMP-7 expression was increased, paralled with syndecan-2 expression. proMMP-7 bound to syndecan-2 and syndecan-2 expression caused polarized MMP-7 localization on cell surface of HT-29 cells. Thus, these results strongly suggest that syndecan-2 enhances the metastatic potential of human colon carcinoma HT-29 cells through the induction and activation of MMP-7. In fact, in several colon cancer cell lines, syndecan-2 was highly expressed compared with normal cell lines. Cell biological studies using the extracellular domain of recombinant syndecan-2 (2E) or spreading assay with syndecan-2 antibody-coated plates showed that syndecan-2 mediated adhesion and cytoskeletal organization of most colon cancer cells. This interaction was critical for the proliferation of colon carcinoma cells. Blocking with 2E or antisense syndecan-2 cDNA induced G0/G1 cell cycle arrest with concomitantly increased expression of p21, p27, and p53. Furthermore, inhibition of syndecan-2 expression significantly reduced anchorage-independent growth in colon carcinoma cells. Therefore, increased syndecan-2 expression appears to be a critical for colon carinoma cell behavior, and syndecan-2 regulates tumorigenic activity through regulation of adhesion and proliferation in colon carcinoma cells. On the other hand, in HT1080 fibrosarcoma cells, syndecan-2 regulated migration, invasion into Matrigel and anchorage-independent growth, not cell-ECM adhesion or proliferation, suggesting that different functional roles of syndecan-2 in fibrosarcoma cells. Consistent with the increased cell migration/invasion of syndecan-2-overexpressing HT1080 cells, syndecan-2 overexpression increased phosphorylation and interaction of Focal adhesion kinase (FAK) and phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K), membrane localization of Tiam-1, and activation of Rac. Syndecan-2-mediated cell migration/invasion of HT1080 cells was diminished when (1) cells were cotransfected with nonphosphorylatable mutant FAK Y397F or with other FAK mutants lacking PI3K interactions, (2) cells were treated with a specific PI3K inhibitor, or (3) levels of Tiam-1 were knocked-down with small inhibitory RNAs. Furthermore, expression of several FAK mutants inhibited syndecan-2-mediated enhancement of anchorage-independent growth in HT1080 cells. Therefore, it is likely that syndecan-2 also regulates the tumorigenic activities of HT1080 fibrosarcoma cells and that tumorigenic activity of syndecan-2 in fibrosarcoma is regulated by FAK. Taken together, all these data strongly suggest that syndecan-2 plays critical roles in the neoplastic transformation of normal cells and the regulation of tumorigenic activity of both colon carcinoma and fibrosarcoma cells. Finally, these findings indicate that syndecan-2 plays a critical role as a multi-functional adhesion receptor in cancer progression.;Syndecan-2 는 transmembrane heparin sulfate proteoglycan 으로서 다양한 생물학적 기능에 관여한다. 주로 mesenchymal 세포와 여러가지 세포의 이동 환경에서 발현되는 것으로 알려져있으나, 암세포에서의 syndecan-2의 기능은 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 논문에서는 대장암 세포와 육종암 세포에서의 syndecan-2의 역할과 조절 메커니즘을 살펴보았고, 이를 통해 syndecan-2가 암세포의 암활성을 조절하는 다기능 세포부착 수용체임을 규명하였다. 우선, syndecan-2가 발암의 여러 단계의 조절에 관여할 수 있기 때문에, 대장암의 초기 단계에서의 syndecan-2의 기능을 알아보기 위하여, 전이성이 낮은 HT-29 세포주에 syndecan-2의 발현을 증가시켰다. HT-29 세포주에 syndecan-2의 증가는 세포와 세포의 경계가 없어지면서 세포가 쌓여자라는 모양의 변형을 유도하였고, 증가된 세포의 이동, 침투, 증식, 그리고 anchorage-independent growth에 기초한 현저히 증가된 암활성을 보였다. 또한, nude mice에 syndecan-2의 증가된 발현을 가진 HT-29 세포주를 주입했을 때, 암의 크기가 증가되었으며, 대장암 환자의 조직을 이용하여 tissue microarray, immunohistochemistry를 실시하였을 때, 대장암 진행의 초기 단계에서 syndecan-2의 발현이 증가됨을 보였다. 이러한 syndecan-2의 발현은 MMP-7 의 발현증가와 밀접하게 연관되어 있으며, syndecan-2에 의해 유도된proMMP-7은 syndecan-2에 결합하여, HT-29 세포주의 세포 표면에 편중되어 위치하였다. 따라서, 이러한 연구 결과는 syndecan-2가 MMP-7의 발현 유도와 그것의 활성을 통하여 HT-29 대장암 세포주의 전이 능력을 증가시킬 수 있음을 보여주는 것이다. 실제로, 여러 대장암 세포주에서 syndecan-2는 정상세포주에 비해 증가된 발현을 보였다. 재조합된 syndecan-2 의 extracellular 도메인 (2E)을 이용한 adhesion assay나 syndecan-2 항체를 이용한 spreading assay는 syndecan-2가 대부분의 대장암 세포의 부착과 cytoskeletal organization을 조절할 수 있음을 보여주었다. 또한, 이러한 상호작용은 대장암 세포의 증식에 매우 중요함을 보였다. 2E나 syndecan-2 안티센스 cDNA를 이용하여 syndecan-2를 저해했을 때, 세포주기의 G0/G1 arrest 가 유도되었고, 이와는 반대로 p21, p27, 그리고 p53의 발현이 증가되었으며, 대장암 세포의 anchorage-independent growth가 현저히 감소되었다. 따라서, 이러한 결과들은 증가된 syndecan-2의 발현이 대장암 세포의 작용에 매우 중요하며, syndecan-2가 이들 세포들의 세포부착이나 증식의 조절을 통하여 암활성을 조절한다는 것을 제시한다. 반면에, HT1080 육종암 세포에서 syndecan-2는 암세포의 이동, matrigel로의 침투, 그리고 anchorage-independent growth의 조절에 관여하나, 세포의 ECM의 부착, 증식엔 관여하지 않음으로써, 육종암 세포에서 다른 역할을 수행할 수 있음을 보여주었다. HT1080 세포주에서 증가된 syndecan-2의 발현으로 인한 세포의 이동과 침투의 증가는 focal adhesion kinase (FAK)와 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) 의 인산화와 서로간의 상호작용의 증가를 유도하였고, Tiam-1의 세포표면으로의 이동과, Rac의 활성을 증가시켰다. 이와는 반대로, 1) 인산화될 수 없는 돌연변이 FAK Y397F 또는 PI3K와의 상호작용을 막는 FAK 돌연변이를 도입시켰을 때, 2) 특이적 PI3K 저해제를 세포에 처리했을 때, 또는 3) siRNA를 이용해 Tiam-1의 발현을 억제시켰을 때, syndecan-2 에 의한 HT1080 세포주의 세포 이동과 침투가 저해되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들은 syndecan-2가 FAK를 통해서 육종암의 암활성을 조절할 수 있음을 보여주는 것이다. 결론적으로, syndecan-2는 대장암과 육종암 세포 모두의 암활성 조절에 깊게 관여함으로써, 암의 진행에 있어서 다기능 부착 수용체로서 중요한 역할을 수행함을 제시한다.-
dc.description.tableofcontentsAbstract = i I. 서론 = 1 A. Syndecans = 2 A-1. Syndecans의 구조 = 2 A-2. Syndecans의 발현 = 9 A-3. Syndecans의 생물학적 기능 = 10 A-4. Syndecans과 암 = 16 A-5. 암에서의 syndecan-2의 기능 = 18 B. 대장암 = 22 B-1. 대장암의 유전적 그리고 분자적 기초 = 23 B-1-1. The APC/b-Catenin Pathway = 26 B-1-2. The DNA Mismatch Repair Pathway = 26 B-1-3. The TGF- b /SMAD Pathway = 29 B-1-4. The Ras Pathway = 30 B-1-5. The p53 Pathway = 30 C. 육종암 = 32 C-1. Abnormalities in the RB and p53 pathways = 32 C-2. Abnormalities in growth-factor signalling pathways = 33 D. FAK = 34 D-1. FAK의 구조 = 34 D-2. FAK 활성 기작 = 36 D-3. FAK와 암 = 40 E. Matrix Metalloproteinase = 42 E-1. MMP biology and chemistry = 42 E-2. MMPs 와 대장암 = 46 F. 논문의 목적 = 51 2. 본론 I = 52 A. 서론 = 53 B. 재료 및 방법 = 55 B-1. 재료 = 55 B-2. 세포주, 배양 그리고 처리 = 55 B-3. RNA 추출과 Reverse Transcription PCR (RT-PCR) = 56 B-4. Immunoblotting = 56 B-5. 안티센스 syndecan-2 cDNA의 주입 = 57 B-6. 재조합 syndecan-2E 와 –4E = 57 B-7. Plating 실험 = 57 B-8. Cell proliferation assay = 58 B-9. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) = 59 B-10. Anchorage-independent growth in Soft Agarose = 59 C. 결과 = 61 C-1. Syndecan-2는 암세포에서 높게 발현된다 = 61 C-2. Syndecan-2는 ECM에 대한 대장암 세포의 세포 부착을 매개한다 = 61 C-3. Syndecan-2는 대장암 세포의 증식을 조절한다 = 71 C-4. Syndecan-2의 증가된 발현은 대장암 세포의 anchorage-independent growth 에 중요하다 = 78 D. 논의 = 80 3. 본론 II = 83 A. 서론 = 84 B. 재료 및 방법 = 87 B-1. 시료와 안티바디 = 87 B-2. 세포 배양 = 87 B-3. Syndecan-2 cDNA의 주입 = 87 B-4. Immunoblotting = 88 B-5. RNA 추출과 Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) = 88 B-6. Invasion and migration assay = 89 B-7. Gelatinase Activity = 89 B-8. Cell proliferation assay = 90 B-9. Confocal Microscopy = 90 B-10. Flow Cytometry = 90 B-11. Anchorage-independent growth in Soft Agarose = 91 B-12. Microarray analysis = 91 B-13. 조직 샘플 준비 = 92 B-14. Primary tumor formation = 92 B-15. Immunohistochemistry = 92 C. 결과 = 94 C-1. Syndecan-2는 대장암 초기에 높게 발현된다 = 94 C-2. Syndecan-2의 발현은 대장암 세포의 부착과 침투력과 연관이 있다 = 98 C-3. Syndecan-2의 증가된 발현은 HT-29 대장암 세포주의 암활성과 관련있다 = 98 C-4. Syndecan-2는 primary tumor formation을 가속화 시킨다 = 102 C-5. Syndecan-2는 HT-29 세포주에서 특이적으로 MMP-7의 발현을 증가시킨다 = 109 C-6. MMP-7의 발현은 HT-29 대장암 세포주에서syndecan-2의 발현과 연관성이 있다 = 109 C-7. Syndecan-2는 직접적으로 proMMP-7과 상호작용하고 그것의 활성을 조절한다 = 117 D. 논의 = 121 4. 본론 III = 123 A. 서론 = 124 B. 재료 및 방법 = 127 B-1. 재료 = 127 B-2. 세포배양과 주입 = 127 B-3. Molecular constructs = 127 B-4. siRNA Constructs의 합성 = 128 B-5. RNA 추출과 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) = 128 B-6. Immunoprecipitation and Immunoblotting = 129 B-7. Cell-fractionation experiment = 130 B-8. Invasion and migration assay = 130 B-9. GST-PAK-PBD binding assay = 131 B-10. Flow Cytometry = 131 B-11. Anchorage-independent growth in soft agarose = 131 C. 결과 = 133 C-1. Syndecan-2는 HT1080 세포주의 이동과 침투를 조절한다 = 133 C-2. Syndecan-2는 FAK-PI3K에 의존적으로 HT1080 세포주의 이동과 침투를 조절한다 = 136 C-3. Syndecan-2의 증가된 발현은 Tiam-1을 통한 Rac의 활성을 유도한다 = 142 C-4. Syndecan-2가 유도하는 HT1080 육종암 세포주의 anchorage-independent growth는 FAK-PI3K에 의한 signaling에 의해 유도된다 = 143 D. 논의 = 149 5. 논의 = 153 A. 대장암에서 syndecan-2의 총체적 역할 = 154 B. 대장암의 초기 단계에서의 syndecan-2의 역할과 조절 = 156 C. 대장암에서 syndecan-2에 의해 유도되는 발암의 분자적 기작 = 161 C-1. Syndecan-2는 integrins과 함께 새로운 signal을 만들어내거나 또는 존재하는 signal을 변형시킬 수 있다 = 161 C-2. Syndecan-2는 암특이적 세포표면 docking 수용체로 기능할 수 있다 = 163 C-3. Syndecan-2의 증가된 발현은 그것의 ectodomain의shedding을 통해서 새로운 수요성 리간드를 만들어 낼 수 있다 = 164 C-4. Syndecan-2는 genetic pathways와 함께 암활성을 조절할 수 있다 = 166 C-5. Syndecan-2는 암활성을 위해 다른 syndecans signaling을 조절할 수 있다 = 166 D. 육종암에서 syndecan-2의 역할과 조절 = 171 E. 결론 = 174 6. 참고문헌 = 175 7. 논문개요 = 209 8. 감사의 글 = 212 9. Curriculum Vitae = 214-
dc.format.extent2735947 bytes-
dc.publisher이화여자대학교 대학원-
dc.titleSyndecan-2, a multi-functional adhesion receptor in cancers-
dc.typeDoctoral Thesis-
dc.creator.othernamePark, hae-in-
dc.format.pageii, 216 p.-
dc.identifier.major대학원 분자생명과학부- 2-
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Ph.D
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