Molecular mechanism of receptor-mediated reactive oxygen species (ROS) generation

Abstract

활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)은 외부자극에 의하여 세포막에 위치해 있는 NADPH oxidase 를 통해 생성되는 물질로 세포 성장, 분화, 사멸 등 이차신호전달 물질로 중요하게 여겨지고 있다. 세포 내 생성된 활성산소종은 NF-kB, AP-1과 같은 전사인자 (transcription factor) 의 활성화 및 ERK, p38, JNK, MAP Kinase 의 활성화, PLA2, PKC, PLC 등의 활성 및 세포내부의 calcium변화와 같은 신호전달체계에 관여하고 있다. Neutrophil, monocyte, macrophage 등과 같은 포식세포는 외부의 박테리아나 바이러스 및 여러 침입에 대해 면역작용에 관여하게 된다. 이 면역작용 중 중요한 과정 중 침입한 물질을 포식세포 내로 함몰하여 죽이는 과정 중 활성산소종이 매우 중요한 기능을 한다고 알려져 있다. 포식세포 내에는 N＿ADPH oxidase (Nox) family 중 p91 ^(phox) (Nox2) 라는 효소를 통해 superoxide (O²-), hydrogen peroxide (H₂o₂) 등의 활성산소종을 만든다. 이 효소는 두개의 막 단백질과 (gp91^(phox), gp22^(phox)) 세 개 이상의 세포질 단백질(p67^(phox), p47 ^(phox), p40 ^(phox), Rac (1 or 2))로 구성되어 있으며, 외부의 자극이나 침입에 의해 세포질 단백질이 세포 내 여러 kinase에 의해 인산화 되게 되고 이런 인산화는 다른 단백질과의 결합을 유도하게 된다. 이렇게 세포질 단백질(p67 ^(phox), p47 ^(phox), p40 ^(phox)) 이 인산화 되어 서로가 complex를 이루어 막 단백질로 이동하여 NADPH oxidase complex를 이룬다. 이로서 전자의 이동이 이 complex로 이루어져서 활성산소종이 생성되게 된다. 또한 small GTP-binding protein인 Rac 단백질은 NADPH oxidase의 활성에 필수적인 역할을 한다. 최근에는 Rac(1or2) 단백질이 독립적으로 활성산소종 생성을 유도한다는 연구도 있다. 이런 활성산소종의 생성 연구는 포식세포뿐 아니라 비포식세포에서도 이루어 지고 있다. Platelet-Drived Growth-Factor(PDGF), Epidermal Growth-Factor(EGF), Fibroblast Growth-Factor (FGF)등과 같은 여러 성장인자 및 insulin, Angiotensin II 등과 같은 호르몬 등이 ROS 생성을 유도한다고 알려져 있다. 비포식세포에는 포식세포에서의 p91 ^(phox) (Nox2)뿐만 아니라 Nox2의 유사체인 다른 NADPH oxidase family; Nox1, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2등을 다양하게 발현하고 있다. 발현의 정도는 조직마다 다르며 Nox1의 경우 colon조직 및 colon관련 암 세포에 많이 발현되어 있으며, Nox3의 경우 kidney, liver, lung 등의 fetal tissue에 많이 발현되어 있다. Nox4는 kidney, smooth muscle cells, endothelial cells 등에 과발현 되어 있다고 보고되고 있다. 이 Nox family의 기능은 궁극적으로 ROS 를 생성하는 것이지만, 각각의 단백질등이 ROS 를 생성하기위한 조절기전은 현저히 다른 것으로 연구, 발표되고 있다. 또한 어떠한 성장인자가 Nox family를 어떻게 조절 및 자극하는지에 대한 연구도 최근 많이 발표되고 있다. Nox1 의 경우 성장인자에 의해 발현 및 기능이 조절된다는 보고가 있으며 쥐의 섬유아세포인NIH3T3 세포에 Nox1을 과발현 했을 때 H₂o₂의 생성이 정상에 비해 현저히 증가하며 이로인해 성장속도가 빨라지고 암을 유발할 수 있다는 보고도 있다. Nox4의 경우 노화와 관계하며, 파골세포의 분화 및 기능조절에도 관여한다고 알려져 있다. 최근 논문에선 지방세포인 3T3L1 adipocyte 에서 insulin에 의한 ROS 의 생성에 Nox4 가 관여한다고 밝혔다. 이 논문에서 우리는 PDGF와 EGF 같은 성장인자에 의한 ROS 생성에 Nox1 이 관여하는 조절기전과, 면역에 관련한 신호전달에서 Lipopolysaccaride (LPS) 에 의한 신호전달에서 Nox4의 역할에 대하여 논하고자 한다. 또한 인슐린 작용의 유전적 결함에 의한 당뇨의 하나인 Leprechaunism에서 Nox4의 발현과 조절에 대해서도 논할 것이다. 앞서 언급했듯이 Ras 와 Rac (1 or 2)를 포함하는 small GTPase가 성장인자에 의한 활성산소종의 생성에 필수적이며, 비포식세포에서 활성산소종의 생성은 Rac 뿐 아니라 PI3-kinase 와 밀접한 관계가 있음이 보고 되고 있다. 이를 바탕으로 Rac-GEF (Rac을 비활성형태인 GDP-Rac으로부터 활성화형태인 GTP-Rac으로 바꾸는 단백질) 로 알려진 βPix가지고 PI3K를 의존한 활성산소종의 생성을 실험하였다. 본 실험에서는 βPix를 mRNA 상태에서 발현을 억제하는 siRNA 를 사용하여 EGF, PDGF에 의한 ROS생성에 βPix가 중요함을 밝혀내었다. 또한 βPix의 여러 domain중, 세포막의 지질과 결합하는 PH domain을 통해 PI3-Kinase 활성의 부산물과 결합함으로서 ROS 생성을 촉진함을 밝혀내었다. 또한 βPix가 성장인자에 의한 ROS 생성에 있어서 Nox1의 C terminal 부분과 결합하여 기능하며, 자극에 의해 활성화된 GTP-Rac 또한 Nox1의 C terminal 부분과 결합함을 알아내었다. 최근 여러논문에서 Nox1의 기능에 있어 p67 ^(phox)의 유사체인 Noxa1 및 p47 ^(phox) 의 유사체인 Noxo11이 중요하다고 보고하고 있다. 우리의 실험결과 Noxo11은 Nox1뿐만 아니라 βPix와도 결합하였다. 결론적으로 비포식세포에서 성장인자에 의한 PI3-Kinase의 활성이 그의 부산물인 PIP3를 세포막부분에 만들어 내고 βPix의 PH 부분이 이를 인지하여 결합하게되면 그 기능이 활성화 된다. 활성화된 βPix는 Rac을 활성화시키며 GTP-Rac은 Nox1에 결합하여 ROS 생성을 자극하게 된다. 이렇게 생성된 ROS는 세포내에서 앞서말한 여러 신호전달에 중요한 이차신호물질로 기능하게 될 것이다. 사람은 외부에서 오는 많은 병원균에 대항하기 위하여 정교한 면역체계를 가지고 있다. 특히, 동물세포는 병원균의 표면에 있는 LPS(lipopoly-saccharide, 지방고분자)를 인식하는 단백질인 TLR4(Toll-like receptor4)를 통하여 선천성 면역반응을 주도한다. 우리는TLR4에 의한 면역반응에 활성산소종이 필수적이며, TLR4와 Nox4 단백질들이 상호작용을 통하여 이러한 활성산소종이 생산된다는 것을 밝혀냈다. 또한 Nox4가 LPS 에 의한 면역 반응중, 세포사이에서 염증세포들을 활성화하고, 그들을 염증부위로 유인하는 화학유인인자인 MCP-1(monocyte chemoattractant protein), IL-8(interleukin-8) 과 같은 cytokine의 생성 및 염증세포들이 결합할 수 있도록 도와주는 adhesion molecule인 ICAM-1의 (intracellular adhesion molecule-1) 의 발현에도 중요한 기능을 함을 실험하였다. 즉 Nox4에 의한 ROS 의 생성이 염증반응에 있어서 중요한 기능을 함을 밝혀낸 것이다. 최근 여러 논문에서 insulin에 의한 신호전달에 ROS가 관여하며 그것이 Nox4 에 의해 생성된다는 보고가 있다. 이를 바탕으로 인슐린 작용의 유전적 결함에 의한 당뇨의 하나인 Leprechaunism에서 NADPH oxidase family를 실험해 본 결과 정상에 비해 Nox4가 현저히 감소되어 있음을 확인 할 수 있었다. 이미 오래전부터 Leprechaunism 환자 세포에서는 정상세포에 비해 성장인자 및 호르몬에 대한 하위 신호전달이 잘 가고 있지 않음이 알려져 있었다. 우리는 이 실험을 통해 Nox4의 발현의 감소로 인해 ROS 생성 및 하위신호전달이 가고 있지 않음을 알아내었다. 위의 실험을 통해서 우리는 ROS 생성의 메커니즘을 알 수 있었으며, 또한 각각의 Nox family 가 다른 성장인자나 호르몬에 의해 coupling을 통해 조절됨을 알아낼 수 있었다.;In recent years, it has become apparent that endothelial cells and other nonphagocytic cells constitutively express a superoxide generating enzyme analogous to the phagocyte NADPH oxidase of neutrophils. The membrane-integrated protein Nox family plays a crucial role in cellular signaling, including host defense, hormone biosynthesis, fertilization, and redox signaling involved in mitogenesis, apoptosis, or oxygen sensing. In part Ⅰ, I will describe about the role of Nox1 in EGF induced ROS generation. Generation of reactive oxygen species (ROS) in cells stimulated with growth factors requires the activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and Rac protein. I report here that the COOH-terminal region of Nox1, a protein related to gp91phox (Nox2) of phagocytic cells, is constitutively associated with βPix, a guanine nucleotide exchange factor for Rac (Rac-GEF). Both growth factor?induced ROS production and Rac1 activation were completely blocked in cells depleted of βPix by RNA interference. Rac1 was also shown to bind to the COOH-terminal region of Nox1 in a growth factor-dependent manner. Moreover, depletion of Nox1 by RNA interference inhibited growth factor?induced ROS generation. These results suggest that ROS production in growth factor?stimulated cells is mediated by the sequential activation of PI3K, βPix, and Rac1, the latter of which then binds to Nox1 to stimulate its NADPH oxidase activity. In part Ⅱ, I will describe about the role of Nox4 in LPS signaling. Lipopolysaccharide (LPS), the primary constituent of the outer membrane of Gram-negative bacteria, is recognized by Toll-like receptor 4 (TLR4). Binding of TLR4 to LPS triggers various cell signaling pathways including NF-κB activation and reactive oxygen species (ROS) production. LPS also trigger secretion of various chemokines and adhesion molecules. These various chemokines and adhesion molecules contribute to the interaction between endothelial cells and leukocytes and are upregulated by proinflammatory mediators and cytokines. Leukocyte-endothelial interaction is a critical step for development of inflammatory vascular lesions. Here, I present the data that LPS-induced ROS generation and NF-κB activation are mediated by a direct interaction of TLR4 with Nox4 in HEK293T cells. Yeast two hybrid and GST pull-down assay indicated that COOH-terminal region of Nox4 interacted with the cytoplasmic tail of TLR4. Knockdown of Nox4 by transfection of siRNA specific to Nox4 isozyme in HEK293T cells expressing TLR4 along with MD2 and CD14 resulted in inhibition of LPS-induced ROS generation and NF-κB activation. Taken together, these results indicate that direct interaction of TLR4 with Nox4 is involved in LPS-mediated ROS generation and NF-κB activation. Moreover recently, several papers suggest that this ROS generation and NF-κB activation is critical for the cytokine production and adhesion molecule expression. To test whether Nox4 has an effect on LPS induced chemokines and adhesion molecules in cells, we used human aortic endothelial cells (HAECs). Downregulation of Nox4 by siRNA in HAECs resulted in a failure to induce ROS generation and subsequent expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and chemokines such as IL-8 and MCP-1 in response to LPS. Furthermore, transient transfection of endothelial cells with Nox4-siRNA significantly suppressed LPS-induced migration and adhesion of monocytes, which were mediated by monocyte chemotactic protein (MCP)-1 and ICAM-1, respectively. Collectively these results indicate that Nox4 plays a central role in LPS-induced proinflammatory responses by endothelial cells in a ROS-dependent manner. In part Ⅲ, I will explain about impaired generation of ROS generation in Leprechaunism through downregulation of Nox4. Leprechaunism features a clinical constellation characterized by extreme insulin resistance, growth retardation, and several distinct developmental abnormalities. One puzzling question about Leprechaunism is that mutations in insulin receptor gene, frequently associated with this syndrome, cannot account for the aberrant responses of cultured cells to other growth factors. Here, we show an impairment of reactive oxygen species (ROS) generation in cells from Leprechaunism patients shedding new light on this question. Stimulation of the patient drived skin fibroblast cells with PDGF resulted in a lower level tyrosine phosphorylation of cytosolic proteins compared to that of cells from normal control. In addition, consistent with the notion that ROS mediates the level of tyrosine phosphorylation of cytosolic proteins through inactivation of protein tyrosine phosphatases, the patient drived fibroblast cells showed a significantly higher phosphatase activity than normal cells. Moreover, the low level tyrosine phosphorylation by growth factor appears to result from the downregulation of NADPH oxidase, Nox4, which in turn results in a reduction of ROS generation. Finally, ectopic expression of Nox4 in the patient fibroblast cells restored PDGF-induced ROS production. Taken together, these data suggest a mechanistic basis for the growth retardation associated with Leprechaunism syndrome.