Systematic Analysis of VEGF, H₂O₂, and Ang1-Mediated Signaling Pathways in HUVECs : Proteomic & Functional Characterization

Abstract

Angiogenesis, the generation of new capillaries from preexisting one, is an essential process in physiological and pathological processes, e.g., embryonic development, the menstrual cycle, wound healing, tumor growth and metastasis, rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, atherosclerosis and vascularization of the myocardium. The process of angiogenesis is well regulated to maintain the cellular homeostasis by balancing endothelial cells in proliferation and apoptosis. Endothelial survival is controlled by several angiogenic growth factors, vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and angiopoietin-1 (Ang1). VEGF induces the formation of new capillary vessels in early stage of angiogenesis, and Ang1 induces vessel maturation and stabilization of neovascular networks. These facts suggest that VEGF and Ang1 act in a complementary way in angiogenesis as a ligand of VEGFR-2 and Tie2 receptor tyrosine kinase, respectively. Ligand binding to various tyrosine kinase receptors such as EGFR, FGFR, TGFR, PDGFR, and VEGFR activates the tyrosine kinases and mediates angiogenic signaling by ROS generation, and activation of downstream signaling cascades. In this study, the effects of VEGF and Ang1 in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were examined in terms of ROS generation, target proteins of receptors and signaling cascades using H₂O₂ as a positive control, and also discriminated in ROS dependent or independent manner in response to VEGF or Ang1. The systematic analyses were performed to understand overall angiogenic processes. Tyrosine-phosphorylated proteins in HUVECs were globally identified as the target proteins of VEGF receptor or Tie2 receptor. Tyrosine-phosphorylated proteins in HUVECs treated with VEGF, H₂O₂, or Ang1 were separated by 2-D gel electrophoresis, detected with western blot analysis using phosphotyrosine antibody and identified by using MALDI-TOF MS and nano-LC-ESI-Q-TOF MS. Tyrosine-phosphorylated 95 protein spots were chosen in response to VEGF and H₂O₂. 63 proteins of them were identified by systematic proteomic analysis. Of these, 44 proteins, as 14 proteins acting in nucleic acid binding proteins (26 spots), 14 proteins with cell motility and structural functions (24 spots), and 16 proteins acting in cell growth or maintenance (19 spots) were identified. Tyrosine-phosphorylated 69 protein spots were also chosen in response to Ang1. 66 proteins were identified from 69 protein spots, and of them, 26 proteins (28 spots) acting in cell growth or maintenance were identified. These results suggest that VEGF activates nucleic acid binding proteins to regulate angiogenesis related gene transcription/ translation, and Ang1 regulates stabilization of endothelial cell networks through modulating tyrosine phosphorylation of proteins acting in cell growth or maintenance. Protein separation on 2-D gel electrophoresis also revealed that heterogeneous populations of same proteins responded in different ways to VEGF and H₂O₂. The results analyzed by bioinformatic tools provide new insights into VEGF, H₂O₂, and Ang1-induced signaling pathways and also suggest new direction for functional studies of targets proteins involved in angiogenesis. Next, reactive oxygen species (ROS) production was investigated whether it plays a key role in Ang1-mediated angiogenesis. We found that HUVECs treated with Ang1 produced ROS transiently, and then were suppressed by NADPH oxidase inhibitor, DPI and rotenone. The Ang1-induced ROS was identified as H₂O₂ using adenovirus-catalase infection. Removal of H₂O₂ by adenovirus-catalase significantly suppressed Ang1-induced in vitro endothelial cell migration, and in vivo tubule formation and angiogenesis, and simultaneously suppressed the activation of p44/42 MAPK which is involved in cell migration and delayed the deactivation of Akt phosphorylation known as involved in cell survival. These results demonstrate that Ang1-produced H₂O₂ plays an important role in Ang1-mediated angiogenesis by modulating MAPK activity. In the last part, various natural products have been screened for their ability to enhance Hsp70 expression as anti-apoptotic agent. Glucuronic acid (GA) was found to induce the synthesis of Hsp70, and cells pretreated with GA were significantly tolerant to stress including heat shock and H₂O₂. GA also induced the production of ROS, a process inhibited by NADPH oxidase inhibitor, diphenyleneiodonium chloride (DPI) and antioxidant N-acetylcysteine (NAC). GA-induced ROS production was also inhibited in RacN17 cell line overexpressing a dominant negative mutant of Rac1. Furthermore, GA treatment induces MAPKs activation (SAPK/JNK and p38) and Hsp70 expression in ROS dependent manner, suggesting that GA turns on the signaling pathway by generation of ROS through Rac1. The profiles of newly synthesized proteins by GA were analyzed on 2-D gel electrophoresis and MALDI-TOF MS and found that two families of proteins were expressed by GA. One was similar to the protein family synthesized by heat shock (Hsp70, Hsp73, Hsp65, Hsp90, vimentin, tubulin, Ras homolog), and the other was a family of protein specific to GA (calreticulin, annexin III, thioredoxin peroxidase). From these results, it was suggest that GA-induced stress responses are mediated by ROS generation and are similar, in part, to heat shock-induced responses and GA can be possibly adopted for the protecting agent from cell death.;신혈관 생성은 이미 존재하고 있는 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 과정으로써 생리적, 병리적인 과정, 예를 들면, 배 발생, 조직 재생, 월경 주기, 암 성장 및 전이, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막증, 동맥경화, 심근 관 형성등에 필수적인 과정이다. 신혈관 생성과정은 내피세포의 증식과 사멸의 조절에 의해서 세포내 항상성을 유지하기위해 매우 정밀하게 조절된다. 내피세포의 생존은 EGF, FGF, TGF, PDGF, VEGF, angiopoietin (Ang1)과 같은 다양한 인자에 의해서 조절되며, 그들중에서 특히, VEGF는 신혈관 생성의 초기 단계에서 새로운 관 형성을 유도하고, Ang1은 신혈관 성숙과 네트워크의 안정화를 유도한다. 이러한 사실은 VEGF와 Ang1이 신혈관 생성에서 상호보완적인 방법으로 작용한다는 것을 나타낸다. VEGF(혈관 내피 성장 인자)와 Ang1은 매우 중요한 신혈관 생성 요소로서 그들의 특이적인 tyrosine 인산화 수용체(VEGFR:KDR and Tie2)를 활성화 시킴으로써 신호를 전달하게 된다. EGFR, FGFR, TGFR, PDGFR, VEGFR과 같은 다양한 tyrosine 인산화 수용체에 라이간드의 결합은 tyrosine 인산화 효소를 활성화시키고, ROS생성과 하위체계 신호 전달 경로의 활성화를 유도함으로써 신혈관 생성을 위한 신호을 매개하게 된다. 이 논문에서는 HUVECs(인간 탯줄 내피세포)에서의 VEGF와 Ang1의 효과를 알아보기위해 양성 대조부로 H₂O₂를 사용하여 ROS 생성과 수용체와 신호전달 체계의 target 단백질에대해 연구하였다. 또한, VEGF 또는 Ang1에 의해 tyrosine 잔기가 인산화된 단백질 중 ROS와 관련된 또는 관련되지 않은 단백질을 구분하고자 노력하였다. 총체적인 신혈관 생성 과정을 이해하기위해 체계적인 분석을 우선 수행하였다. HUVECs에서 VEGF 또는 Tie2 수용체의 target 단백질을 총체적으로 확인하기위해 인산화된 단백질을 2D-gel 전기영동으로 분리하고, phosphotyrosine 항체를 사용하여 western blot으로 detection한 후, MALDI-TOF MS와 nano-LC-ESI-Q-TOF MS를 사용하여 target 단백질을 동정 확인하였다. 이 실험을 통해 VEGF 또는 H₂O₂에 의한 차별적인 반응으로 인산화된 95개의 단백질 spot을 검출하였고, 이중 63개의 단백질을 동정 확인하였다. 이들 중, 44개의 단백질은 핵산 결합 단백질 14개(26 spots), 세포 이동 및 구조적인 기능을 하는 단백질 14개(24 spots), 세포 성장 및 유지에 관여하는 단백질 16개(19 spots)로 확인되었다. 또한 Ang1에 대한 반응으로 인산화에 큰 차이를 보이는 69개의 단백질을 찾았고, 이중 66개의 단백질 spot을 동정 확인하였다. 66개중 26개는 세포 성장 및 유지에 관여하는 단백질로 분류되었다. 이러한 결과는 VEGF는 유전자 전사 및 해독과 관련된 신혈관 생성을 조절하는 핵산 결합 단백질의 활성을 조절하고, Ang1은 세포 성장 및 유지에 관련된 단백질의 tyrosine 인산화를 조절함으로써 내피세포의 네트워크를 유지하고, 안정화시키는 역할을 할 것이라는 것을 제안하다. 또한 2D gel 전기영동을 통해 같은 단백질의 이질 군 (heterogeneous populations)이 VEGF 와 H₂O₂에 다르게 반응한다는 것을 확인하였다. 생물 정보학적인 tool을 통한 결과분석은 VEGF, H₂O₂ 또는 Ang1에 의해 유도되는 신호전달 체계에 대한 새로운 관점을 제공하고 신혈관 생성과 관련된 target 단백질의 기능 연구를 위한 새로운 방향을 제시하였다. 다음으로, Ang1에 의해 매개되는 신혈관생성에서 ROS가 어떤 역할을 하는지 알아보았다. Ang1을 처리한 HUVECs에서 일시적으로 ROS가 생성되고, 그것은 NADPH oxidase 억제제인 DPI와 마이토콘드리아 ROS 생성 억제제인 rotenone에 의해 억제되는 것을 확인하였다. Ang1에 의해 유도된 ROS는 대부분 H₂O₂라는 것을 Adenovirus-catalase를 감염시킴으써 확인하였다. Adenovirus-catalase에 의한 H₂O₂ 제거는 Ang1에 의해 유도되는 in vitro 세포이동과 in vitro/in vivo 관형성을 거의 완벽하게 억제하는 것을 관찰하였고, 또한 p44/42 MAPK의 활성을 억제하였고, Akt 인산화의 불활성화를 지연시키는 결과를 얻었다. 이러한 결과는 Ang1에 의해서 유도된 H₂O₂는 Akt, MAPK 인산화의 신호전달 체계를 조절함으로써 신혈관 생성 및 관련 반응에 필수적인 역할을 한다는 것을 제안한다. 마지막으로 anti-apoptotic agent로써 hsp70발현을 증가시키는 다양한 자연 산물 (natural products)을 검색하였다. 검색 결과 glucuronic acid (GA)라는 물질을 찾았고, 그것은 hsp70합성을 유도하고, GA에 의해 전처리된 세포는 heat shock이나 H₂O₂와 같은 자극에 매우 큰 저항성을 갖는 것을 확인하였다. 또한 GA가 NADPH oxidase를 통해 ROS 생성을 유도하고, 그 과정은 NADPH oxidase 억제제인 DPI와 항산화제인 NAC에 의해 억제되었다. GA에 의해 유도된 ROS생성은 또한 Rac1의 dominant negative mutant를 과발현하는 RacN17 세포에서도 억제가 되었다. GA 처리는 ROS에 의존적으로 MAPK(SAPK/JNK and p38) 활성화와 hsp70 발현을 유도하였고, 이러한 결과는 GA가 Rac1을 통한 ROS의 생성에 의해 신호전달 경로를 게시한다는 것을 나타낸다. GA에의해 새롭게 합성되는 단백질의 profiles을 분석하고자 단백질체 분석법(proteomics)을 사용하였다. 두 그룹의 단백질군이 확인되었는데, 한 그룹은 heat shock에 의해 합성되는 단백질 군과 비슷하였고(hsp70, hsp73, hsp65, hsp90, vimentin, tubulin, Ras homolog), 다른 한 그룹은 GA에 특이적으로 합성되는 단백질 군이다(calreticulin, annexin III, thioredoxin, peroxidase). 이러한 결과는 GA에의해 유도되는 스트레스 반응은 ROS 생성에 의해 매개되며, heat shock에 의해 유도되는 반응과 부분적으로는 유사하다는 것을 나타내고, GA는 세포 죽음을 억제할 수 있는 억제제로써 적용 가능하다는 것을 제안한다.