Regulation of the Peroxidase Activity of Peroxiredoxins via Reversible Hyperoxidation of their Catalytic Cysteine to Cysteine Sulfinic Acid

Abstract

Peroxiredoxin은 thiol-containing protein들로부터 전자를 받아 hydrogen peroxide와 alkyl hydroperoxide를 물과 alcohol로 환원시키는 peroxidase이다. Prx는 heme이나 flavin prosthetic group을 가지지 않고, metal ion들과 강하게 결합하지 않는다. 대신 Prx는 NH₂-terminal 부분에 cysteine 잔기를 가지며, 이 cysteine 잔기에 의해 peroxidase 활성을 가지게 된다. Prx의 활성 cysteine 잔기는 H₂O₂에 의해 cysteine sulfenic acid (Cys-SOH)로 선택적으로 산화되며, COOH-terminal 지역에 위치한 다른 cysteine 잔기와 disulfide bond를 형성한다. 이러한 Prx의 active-site의 cysteine 잔기는 그 효소 반응 중에 cysteine sulfinic acid로 선택적으로 산화되어 peroxidase 활성을 잃게 된다. 포유동물군에는 6 종류의 Prx가 존재하며, 이 6 종류는 2-Cys, atypical 2-Cys, 1-Cys Prx의 3 subgroup으로 나뉘어진다. 첫번째 부분에서는 이 6 종류 Prx의 hyperoxidation에 대한 감도를 밝혔다. 세 subgroup은 2-Cys > 1-Cys > atypical 2-Cys의 순으로 활성을 잃었다. 두번째 부분에서는 이러한 sulfinylation이 비가역적 반응인지를 확인해보았다. ^(35)S 방사성 동위원소로 labeling한 포유동물 세포에서, H₂O₂에 의해 산화된 sulfinylated Prx Ⅰ은 빠르게 원래의 활성을 가진 thiol form으로 환원되었다. Two-dimensional gel에서 H₂O₂에 의해 sulfinic acid로 산화된 Prx Ⅰ과 Prx Ⅱ는 더 낮은 pI로 이동하게 되고, 이렇게 이동한 단백질 spot은 H₂O₂를 제거하게 되면 점차로 원래의 pI로 돌아오게 된다. 이러한 단백질 spot의 움직임은 단백질 합성 저해제인 cycloheximide를 가해도 관찰됨으로 이는 새로운 단백질의 합성에 의한 것이 아니라, 기존의 sulfinic acid로 산화되었던 Prx가 세포내에서 thiol form으로 환원되었음을 나타낸다. 이러한 세포내에서의 sulfinic acid의 환원은 기존의 sulfinic acid가 비가역적이라는 것에 대치되는 것이다. Sulfinylated 단백질의 확인은 2D gel이나 질량 분석 등과 같은 복잡한 proteomics 분석에 의해 이루어져왔다. 세번째 부분에서는 더 편리한 분석을 위해 immunoblot방법에 적용할 수 있는 새로운 항체를 개발하였다. Prx Ⅰ에서 Ⅳ까지의 active site의 공통된 부분, Prx Ⅴ, Prx Ⅵ, glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 각각의, active cysteine을 가지는 부분의 peptide를 sulfonic acid로 산화시킨 후, 이 산화된 peptide에 대한 항체를 만들었다. 이 항체들은 H₂O₂를 처리한 세포에서 sulfinic acid 형태로 산화된 Prx와 GAPDH 효소를 특이적으로 인식하였다. 이 산화된 단백질 특이적 항체를 이용해서 세포 내에서 cytosol에 존재하는 Prx Ⅰ, Ⅱ 뿐만 아니라 mitochondria에 존재하는 Prx Ⅲ의 sulfinic acid도 환원됨을 다시 확인하였다. 최근 yeast에서 yeast Prx의 sulfinic acid를 환원시키는 효소인 sulfiredoxin이 발견되었다. 그리고 yeast 효소의 mammalian ortholog들도 또한 mammalian sulfinic Prx를 환원시킨다는 것이 밝혀졌다. Prx 외의 다른 많은 단백질에서도 특정 cysteine 잔기들이 sulfinic acid로 산화된다. 이러한 사실은 다양한 단백질에서 가역적 sulfinylation이 세포내의 산화, 환원 상태에 따라 단백질의 기능을 조절할 수 있는 스위치로서의 기능을 할 수 있으리라는 가능성을 제시한다. 따라서 네번째 부분에서는 Srx가 다른 단백질의 sulfinic acid도 환원하는 지를 확인하기 위해 모든 6 종류의 mammalian Prx와 GAPDH의 sulfinic form이 Srx의 기질이 될 수 있는지를 알아보았다. 정제된 Srx 단백질은 2-Cys Prxs의 sulfinic acid는 환원시켰으나 Prx Ⅴ, Ⅵ, GAPDH에서는 환원시키지 못하였다. 또한 Srx는 2-Cys Prx와 선택적으로 결합함을 yeast 2-hybrid analysis에서 확인할 수 있었다. 세포 내에서는 H₂O₂ 처리에 의해 생성된 sulfinic acid 중 Prx Ⅰ과 Ⅱ는 환원이 되었고, Srx의 과발현에 의해서는 그 환원 속도가 빨라졌으며, siRNA를 통해 Srx의 발현을 저해하자 그 속도가 느려졌다. 그러나 Srx의 과발현이나 저해 여부에 관계없이 Prx Ⅵ와 GAPDH의 sulfinic acid 는 세포 내에서 환원되지 않았다. 이러한 결과는 Srx에 의한 sulfinic acid의 산화가 2-Cys Prx에 특이적이라는 것을 나타난다. Prx Ⅵ나 GAPDH와 같은 단백질에서는 sulfinic acid로의 산화가 단백질의 손상을 유발시키는 비가역적 반응일 가능성이 있다. 이상의 실험을 통해 Prx isoform 간의 oxidative inactivation에 대한 sensitivity를 조사하였고, 그 결과 2-Cys Prx가 가장 oxidation이 잘 일어남을 확인하였다. Trx와 같은 생체 내에 존재하는 환원제에 의해서는 Prx의 sulfinic acid가 환원될 수 없으므로 지금까지는 sulfinylation에 의해 Prx의 기능이 영구적으로 손상된다고 생각되어왔다. 그러나 2D gel 분석과, sulfinylated 단백질에 특이적인 항체를 이용한 실험을 통해 cysteine sulfinic acid가 세포 내에서 환원된다는 것을 본 실험에서 밝혔다. 또한 Prx의 sulfinic acid를 환원시키는 효소인 Srx의 기질 특이성을 조사한 결과, Srx에 의한 sulfinic acid의 환원은 2-Cys Prx에 특이적이라는 사실도 밝혔다.;Peroxiredoxins (Prxs) are a family of peroxidases that reduce hydrogen peroxide and alkyl hydroperoxides to water and alcohol, respectively, with the use of reducing equivalents provided by thiol-containing proteins. Prxs contain neither a heme or a flavin prosthetic group nor tightly bound metal ions, but they contain a conserved cysteine residue at the NH₂-terminal region on which their peroxidase activity entirely depend. Upon reaction with H₂O₂, the reactive cysteine is selectively converted to cysteine sulfenic acid (Cys-SOH), which then reacts with the COOH-terminal conserved Cys-SH to form a disulfide. The active-site cysteine of Prxs occasionally undergoes hyperoxidation to cysteine sulfinic acid (Cys-SO₂H) during catalysis, which leads to inactivation of peroxidase activity. There are six members of Prx enzymes in mammals, and these proteins can be divided into three subgroups referred to as 2-Cys, atypical 2-Cys, and 1-Cys. In the first part of current study, the relative susceptibility of the six Prx isoforms to hyperoxidation was studied: their susceptibility decreased in the rank order of 2-Cys > 1-Cys > atypical 2-Cys both in vitro and in vivo. In the second part, whether the hyperoxidation is reversible or not has been investigated. By metabolic labeling of mammalian cells with ^(35)S, we show that the sulfinic form of Prx I, produced during the exposure of cells to H₂O₂, is rapidly reduced to the catalytically active thiol form. On two-dimensional (2D) gels, the intensity of the ^(35)S-labeled acidic spots corresponding to sulfinylated Prx Ⅰ and Prx Ⅱ increased during exposure of cells to H₂O₂ and then decreased as the intensity of the spots corresponding to the respective reduced forms of the enzymes increased after removal of H₂O₂ in the presence of the protein synthesis inhibitor cycloheximide suggesting that the hyperoxidation to cysteine sulfinic acid is reversible in cells. This ability of mammalian cells to reduce protein sulfinic acid is contrary to the general belief that oxidation to the sulfinic state is an irreversible process in cells. Because the detection of sulfinylated Prx proteins relied on complex procedure involving isotopic labeling of cells, 2D-PAGE, and mass spectrometry, in the third part, a simplified immunoblot method was developed. We prepared rabbit antibodies to sulfonylated peptides based on the active site sequence to mammalian 2-Cys (Prx Ⅰ to Ⅳ), to atypical (Prx Ⅴ), or to 1-Cys (Prx Ⅵ) Prxs. In addition, rabbit antibodies to sulfonylated peptide derived from the active site sequence to glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) were also prepared. These antibodies allowed the detection of sulfinylated Prxs and GAPDH enzymes in H₂O₂-treated cells with high sensitivity and specificity. With the use of these antibodies, we demonstrated that not only cytosolic enzymes Prx Ⅰ and Ⅱ but also mitochondrial enzyme Prx Ⅲ undergo reversible sulfinylation. Subsequently, it was shown by others that sulfiredoxin (Srx) is responsible for reduction of sulfinic Prx in yeast and that mammalian orthologs of yeast Srx act on hyperoxidized mammalian Prxs. Given that specific Cys residues of many other proteins are also oxidized to sulfinic acid, it became important to know whether the cycle of thiol to sulfinic acid might represent general switch by which the function of a wide variety of proteins is regulated in response to a change in intracellular redox status. In the fourth part, we examined this possibility. We prepared sulfinic forms of all six mammalian Prx isoforms and GAPDH. Purified Srx reduced the sulfinic forms of the four 2-Cys members (Prx Ⅰ to Prx Ⅳ) of the Prx family in vitro, but it did not affect those of Prx Ⅴ, Prx Ⅵ, or GAPDH. Furthermore, Srx bound specifically to the four 2-Cys Prxs in cells. Sulfinic forms of Prx Ⅰ and Ⅱ, but not of Prx Ⅵ or GAPDH, present in H₂O₂-treated A549 cells were gradually reduced after removal of H₂O₂; overexpression of Srx increased the rate of the reduction of Prx Ⅰ and Prx Ⅱ and inhibition of Srx retarded the reduction of Prx Ⅰ and Prx Ⅱ, but did not induce that of Prx Ⅵ or GAPDH. These results suggest that reduction of Cys-SO₂H by Srx is specific to 2-Cys Prx isoforms. For proteins such as Prx Ⅵ and GAPDH, sulfinic acid formation might be an irreversible process that causes protein damage. In this study, the differential sensitivity of Prx isoforms to inactivation by H₂O₂ was investigated and we showed that 2-Cys Prxs are most sensitive to hyperoxidation. Physiological reductants are not able to reduce this sulfinic acid moiety of Prx, so such hyperoxidation was thought to result in permanent inactivation of peroxidase activity. On examination of the redox state of Prxs by 2D gel analysis, however, we showed that the oxidation to cysteine sulfinic acid is not an irreversible step as conventionally believed. Because the detection of hyperoxidized Prxs relied on complex proteomics analysis, a simple immunoassay was devised to follow the reversible sulfinylation. The enzyme responsible for the reduction of hyperoxidized Prx, Srx was subsequently identified and we showed that the reduction of cysteine sulfinic acid by Srx is specific to 2-Cys Prxs.