Salmonella typhimurium에 감염된 장상피세포(Caco-2)에서의 urokinase type plasminogen activator(u-PA) 의 발현양상

Abstract

Salmonella typhimurium은 강한 침투력을 갖고 숙주의 소장 점막에 침투하여 질환을 유발한다. 최근 S. typhimurium의 상피세포 부착에 관여하는 수용체와 침투에 관여하는 유전자 등이 보고된 바 있으나, 단백질 분해 효소를 생산하지 않는 이 균의 기저판 (basal lamina) 통과과정에 대해서는 아직까지 규명된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 S. typhimurium의 병인성 연구의 한 측면으로 S. typhimurium감영에 의한 장상피세포(Caco-2 cells)내의 단백 분해효소 발현변화를 탐지하고자 하였다. 즉 감영에 의하여 숙주의 단백분해효소가 유도되어 Salmonella 침투에 관련된 가능성을 실험적으로 확인하고자 urokinase type plasminogen activator(u-PA)의 발현 변화를 S. typhimurium에 감영시킨 장상피세포 (Caco-2)에서 관찰하였다. Nothern blot으로 u-PA의 전사변화를 추적한 결과, 감염 후 2시간에 S. typhimurium 을 감염시킨 세포에서는 대조로 사용한 E. coli를 감염시킨 세포와 세균감염을 시키지 않은 세포에 비하여 u-PA및 u-PA수용체 (u-PAR)의 전사가 뚜렷하게 증가하엿으나, plasminogen activator inhicitor-1(PAI-1)은 S. typhimurium감염세포와 두 대조군에서 차이가 없었다. 세균 감염 후 4시간에는 S. typhimurium 을 감염시킨 세포에서 u-PA 전사가 감소하여 다른 두 대조군과 차이 없이 미약하게 탐지되었다. 한편 u-PA 수용체는 세균제거 후에도 계속 대조군에 비하여 높은 발현을 보였다. 그러나 u-PA 억제물질인 PAI_1전사는 세균감염 2시간 까지는 S. typhimurium과 E. coli 감염세포 모두에서 감염되지 않은 세포와 비슷한 수준으로 전사되었으나 감염 후 4시간에는 오히려 억제되어 탐지되지 않았다. 한편 S. typhimurium 감염 후 2시간 간격으로 얻은 배양상청액의 u-PA 농도는 다른 두 대조군에 비하여 32-58%씩 증가되었고(p<0.05), 이때 두 대조군 간에 유의한 차이는 없었다. 세포용해액 내의 u-PA는 E. coli를 감염시킨 세포에 비해 S. typhimurium을 감염시킨 세포의 용해액 내에서 농도가 유의하게 낮아(p<0.05), 배양상청액내의 u-PA의 증가된 양상과는 반대의 결과를 나타내었다. 결론적으로 S. typhimurium에 감염된 장상피세포(Caco-2)에서는 다른 유도물질의 매개 없이 균 감염 그 자체에 의하여 u-PA의 전사와 세포 밖으로의 분비가 증가하였다. 이때 세포 밖으로의 u-PA 분비는 세포질 내 축적 없이 이루어 지는 것으로 추정되었다. 또한 배양상청액에 u-PA가 계속 축적되고 있음에도 불구하고 세포 내 PAI-1의 발현은 억제되어 정상적인 u-PA 조절 기전에 이상이 있음을 시사하였다.;Salmonella are highly invasive organisms causing diarrhea in human and animals. It has been known that their invasiveness was related with not only several bacterial virulence factors but also signal transduction mechanism of host cells. However, the invasion mechanism through the anatomical barrier of the basal lamina, which must be degraded for Salmonella to reach the target tissue of lamina propria, still remains to be elucidated. Salmonella are not known to secrete any proteolytic enzymes that can degrade the basal lamina, implying that the enzymes may be secreted from the host cells. And Salmonella have been reported to interact with epidermal growth factor receptor of the central enzyme in extracellular proteolysis, urokinase type plasminogen activator(u-PA). In this experiment, u-PA expression was traced in the epithelial cells(Caco-2 cells) infected by S. typhimurium to investigate whether u-PA was involved in the invasion process of S. typhimurium. The expression of u-PA was traced at the transcriptional level by Nothern blot analysis, and at the translational level by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and zymography. At the same time, The transcription of u-PA receptor(u-PAR) and plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) was also and analyzed. Nothern blot analysis showed that the transcription of u-PA and u-PAR was elevated in Caco-2 cells infected by S. typhimurium compared with the noninfected Caco-2 or those infected by noninvasive E.coli. The transcriptional signals increased during the first 2 hours control after removal of bacteria. However, the transcription of PAI-1 did not increase during the first 2 hours postinfection but decreased at 4 hours postinfection. ELISA showed higher concentration of u-PA in the culture supernatants of Caco-2 cells infected by S. typhimurium By contrast, u-PA concentration was lowed in the extracts of S. typhimurium infected Caco-2 cells than those of control. And zymography showed that the produced u-PA normally activated plasminogen. In summary, S. typhimurium infection resulted in increased expression of u-PA and u-PAR in Caco-2 cells, while the expression of PAI-1 that can control the enhanced proteolysis was impaired. These results suggested that u-PA could play an important role in the invasion process of S. typhimurium.