Serial Analysis of Gene Expression(SAGE)와 oligonucleotide microarray를 이용한 CD61+ 세포의 유전자 발현 분석

Abstract

The process of megakaryocytopoiesis during ex vivo expansion of human cord blood (CB) CD34^+ cells using thrombopoietin (TPO) is closely associated with apoptosis. However, the genes involved in the regulation of megakaryocytopoiesis have not yet been characterized. In this study, global gene expression pattern of CD61^+, CD61^- and CD34^+ cells were compared using SAGE and oligonucleotide microarray analysis. CD34^+ cells were cultured sroma free culture system, and produced CD61^+ cells by TPO. CD61^+ and CD61^- cells were separeated immunomagentic slelction. The SAGE tags were analyzed for the CD61^+ and CD61^- cells expanded by treating TPO. A total of 20,580 and 18,329 tags was obtained from CD61^+ and CD61^-, respectively. SAGE and microarray data have correlation constant, 0.422. The genes related apoptosis such as APAF-1, caspase 3 and calpain family were expressed highly in CD61^+ cells. Therefore, megakaryocytic differentiation during ex vivo expansion of CB CD34^+ cells might be strongly associated with apoptosis. Early response genes, such as jun and fos may regulate megakaryocyte specific gene expression. And CD34^+ cells were highly expressed DNA stability related gene such as Mut L and Mut D.;혈액줄기세포를 거핵구로 분화시키는데 thrombopoietin (TPO)를 사용하는 것은 제대혈 이식의 효율을 높이기 위해서 필요한 과정이지만, 이에 대한 연구가 아직 잘 되어 있지 않다. 또한 거핵구의 체외 분화시 세포자멸사 (apoptosis)가 관여한다는 일부 보고 외에는 혈액줄기세포의 분화에 따른 유전자들에 대한 총체적 분석이 없다. 본 연구에서는 제대혈의 CD34^+ 세포에서 TPO에 의해 분화 증폭한 CD61^+ 거핵구 세포의 유전자 발현을 유전자 발현 분석법인 serial analysis of gene expression (SAGE)와 microarray법으로 분석하였으며, 거핵구로 분화에 관련된 유전자군을 발굴하였다. 또한 serial analysis of gene expression (SAGE)와 microarray의 다른 두 방법에서 유전자 발현양상의 상관성을 조사하였다. 연구법은 혈액줄기세포인 CD34^+ 세포를 면역자기 분리법으로 분리한 후, TPO를 첨가하여 10일간 배양하였다. 배양된 세포들은 거핵구의 표면 항원인 CD61에 대한 항체를 이용하여 거핵구 계열의 세포인 CD61^+ 분획과, 과립구 계열의 세포인 CD61^- 분획으로 분리한다. CD34^+, CD61^+ 및 CD61^- 세포에서 RNA를 분리하여 cDNA를 만들어 SAGE법을 이용하여 발현되는 유전자를 염기서열분석을 통해 조사하였고, 한편, 10,368개의 50mer 올리고뉴클레오 티드가 부착된 microarray에 hybridization하여 유전자 발현의 차이를 분석하였다. TPO를 처리하여 배양한 CD34^+ 혈액줄기세포는 CD61 항원을 발현하는 거핵구로 약 60% 정도 분화하게 된다. CD61^+와 CD61^- 분획으로 나누어 SAGE를 시행한 결과 CD61^+, CD61^- 세포 각각에 대해 20,580개와 18,329개의 SAGE tag을 얻었다. SAGE 와 microarray 결과 거핵구 세포인 CD61^+ 세포에서는 apoptosis, 세포골격계 관련 단백질, 대부분의 heat shock protein들이 다른 세포들에 비해 높은 발현양상을 보여 이들 유전자들이 거핵구 분화에 작용할 것으로 생각된다. 혈액줄기세포인 CD34^+ 세포에서는 여러 종류의 전사인자들과 DNA 안정성에 관여하는 유전자들의 높은 발현을 보였다. 그리고 CD61^+와 CD61^- 세포에서는 공통적으로 리보솜 단백질들과 글로빈 유전자들의 발현이 높았다. SAGE와 microarray 결과의 상관관계 상수는 0.422로써 의미 있는 연관을 보였다.