Nitric oxide에 의한 혈관내피세포내 Ca2+ 조절 기전

Abstract

혈관내피세포에서 분비되는 nitric oxide(NO)는 혈관평활근세포내 Ca^2+을 감소시켜 혈관평활근을 이완시키지만 혈관내피세포내 Ca^2+ 농도에 미치는 영향에 대해서는 다양한 보고가 있으며 그 기전도 명확하지 않다. 이에 본 연구에서는 혈관내피세포에서 NO가 세포내 Ca^2+에 미치는 영향과 그 기전을 밝히고자 일차 배양 기법을 이용하여 분리한 쥐의 대동맥 혈관내피세포(mouse aortic endothelial cell, MAEC)와 인간제대정맥 내피세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에서 NO에 의한 세포내 Ca^2+ 변화와 여러 가지 이온전류의 변화를 측정하였다. 연구결과 NO donor인 sodium nitroprusside(SNP)는 혈관내피세포내 Ca^2+을 감소시켰다. 그러나 혈관내피세포들 중 20%(65세포 중 13세포)에서는 다른 양상을 보였는데 혈관내피세포내 Ca^2+이 증가하거나 또는 일시적으로 감소하였다가 곧 증가하는 효과가 관찰되었다. 세포내 Ca^2+을 감소시키는 SNP의 효과는 NO dependent soluble guanylate cyclase 억제제인 1H-[1,2,4]oxadiazole[4,3- a]quinoxalin-1-one(ODQ)에 의하여 억제되었다. 그리고 세포막을 통과할 수 있는 cyclic guanosine monophosphate(cGMP)인 8-bromo cGMP에 의하여 세포내 Ca^2+이 감소되었으며 이러한 8-bromo cGMP의 효과는 cGMP 의존성 protein kinase 억제제인 KT5823에 의하여 억제되어 NO의 효과는 cGMP 의존적 기전을 통하여 세포내 Ca^2+을 감소시킴을 알 수 있었다. 그러나 8-bromo cGMP로 전처치하거나 또는 ODQ로 전처치하고 SNP를 투여하는 경우 세포내 Ca^2+이 증가하여 cGMP 비의존적 기전을 통하여 세포내 Ca^2+이 증가함을 알 수 있었다. 혈관내피세포내 Ca^2+ 농도는 막전압이 저분극되면 감소하였으며 과분극되면 증가하였다. 혈관내피세포의 막전압을 과분극시키는 intermediate conductance Ca^2+ -activated K^+ current(IK_Ca)와 large conductance Ca^2+ -activated K^+ current(BK_Ca)는 NO donors와 8-bromo cGMP에 의하여 억제되었으며 cGMP와 ODQ로 동시에 전처치하거나 또는 ODQ로 전처치하였을 때에는 SNP에 의하여 오히려 활성화되었고 catalase에 의하여 더욱 활성화되었다. 결론적으로 NO는 혈관내피세포에서 cGMP 의존적으로는 세포내 Ca^2+을 감소시키고 cGMP 비의존적으로는 세포내 Ca^2+을 증가시키는데, NO가 세포내 Ca^2+을 감소시키는 기전은 cGMP 의존적으로 IK_Ca와 BK_Ca를 억제하기 때문이며 세포내 Ca^2+을 증가시키는 기전은 cGMP 비의존적으로 IK_Ca와 BK_Ca를 활성화시킨 결과로 사료된다.;Nitric oxide(NO) released from endothelial cells relaxes vascular smooth muscle cells by reducing intracellular Ca^2+ concentration([Ca^2+]_i), but the effect of NO on [Ca^2+]_i in endothelial cells is not clear. Therefore, we examined the effect of NO on [Ca^2+]_i and its mechanism in mouse aortic endothelial cells(MAEC) and human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). We observed the change of [Ca^2+]_i, which was measured with the fluorescent Ca^2+ indicator fura-2 and fluorescence imaging microscopy, and the change of K^+ current by NO using patch clamp technique in primary cultured MAEC and HUVEC. Sodium nitroprusside(SNP), a NO donor, decreased [Ca^2+]_i in endothelial cells in 80 % of the cells tested. On the other hand, SNP increased [Ca^2+]_i or decreased [Ca^2+]_i transiently in the rest of the cells. A soluble guanylate cyclase inhibitor, 1H-[1,2,4]oxadiazole[4,3-a]quinoxalin-1-one(ODQ) reversed the effect of SNP. 8-bromo cyclic guanosine monophosphate(cGMP) decreased [Ca^2+]_i, which was inhibited by KT5823, an inhibitor of cGMP-dependent protein kinase. On the other hand, in the presence of 8-bromo cGMP or ODQ, SNP increased [Ca^2+]_i. [Ca^2+]_i was decreased by the depolarization of membrane potential and increased by the hyperpolarization of membrane potential. NO donors and 8-bromo cGMP inhibited intermediate conductance Ca^2+-activated K^+ current(IK_Ca) in MAEC and large conductance Ca^2+-activated K^+ current(BK_Ca) in HUVEC. These K^+ currents were blocked by NO donors and 8-bromo cGMP, whereas, in the presence of cGMP or ODQ, SNP activated IK_Ca and BK_Ca and the stimulatory effect of SNP was further augmented by catalase. In conclusion, it might be suggested that NO reduces [Ca^2+]_i through cGMP-dependent inhibition of Ca^2+ -activated K^+ currents and increases [Ca^2+]_i through cGMP-independent stimulation of Ca^2+ -activated K^+ currents. As the K^+ channels play an indirect role in the modulation of [Ca^2+]_i, the mechanism whereby NO modulates [Ca^2+]_i is as yet unclear and will require further investigation.